Aktywność star

Z Wikipedii, wolnej encyklopedii
Skocz do: nawigacji, wyszukiwania

Aktywność star – własność enzymów restrykcyjnych polegająca na obniżeniu lub zaniku specyficzności ich działania, objawiająca się cięciem DNA w miejscach innych niż restrykcyjne[1]. Wraz ze spadkiem specyficzności, cięciu podlegają miejsca coraz bardziej różne od oryginalnej sekwencji restrykcyjnej. Nazwa zjawiska pochodzi od oznaczenia alternatywnej aktywności, w odróżnieniu od zwykłej, znakiem * (EcoRI* zamiast EcoRI)[1][2][3]. Obecnie produkowane są sztucznie rekombinowane enzymy ze zmniejszoną lub zniesioną aktywnością star.

Najczęstszy zanik specyficzności polega na cięciu sekwencji różniących się od restrykcyjnej jednym nukleotydem, cięciu sekwencji krótszych o nukleotydy początkowe[4].

Na pojawienie się aktywności star w reakcjach z udziałem enzymów restrykcyjnych ma wpływ wiele czynników (choć każdy z różną siłą i to zależnie od enzymu, np. EcoRI jest bardziej wrażliwy na podwyższone stężenie glicerolu niż na podwyższone pH[5]), między innymi:

Aktywność star jest zwykle zjawiskiem niepożądanym, utrudniającym i wprowadzającym zmienność do przeprowadzanego eksperymentu. Problem ten staje się wyraźny w przypadku reakcji z użyciem kilku enzymów restrykcyjnych naraz (cięcie wielokrotne), gdy trudne jest zapewnienie warunków optymalnych każdemu z nich.

Aktywność star można redukować stosując się do zaleceń producenta enzymów, takich jak:

  • używania enzymu w minimalnej ilości potrzebnej do pocięcia danej ilości DNA (zmniejsza ilość glicerolu w próbce oraz zapewnia odpowiedni stosunek enzymu do DNA, wydłuża jednak czas reakcji);
  • pozbycie się śladów odczynników organicznych (szczególnie etanolu używanego powszechnie do izolacji DNA);
  • zapewnienie odpowiednio wysokiej lub specjalne zawyżanie siły jonowej (niektóre enzymy są jednak inhibowane przez wysoką siłę jonową);
  • utrzymywanie pH reakcji w okolicach 7,0 (wyższe pH reakcji bywa efektem używania niewystarczająco czystego DNA izolowanego metodą lizy alkalicznej);
  • używanie Mg2+ jako jonów dwuwartościowych wspomagających pracę enzymu i unikanie zanieczyszczeń innymi jonami.

Przypisy

  1. 1,0 1,1 Nasri M., Thomas D. Relaxation of recognition sequence of specific endonuclease HindIII.. „Nucleic Acids Res”. 03;14. 2, s. 811-21, 1986. PMID 3003698. 
  2. 2,0 2,1 2,2 Polisky B., Greene P., Garfin DE., McCarthy BJ., Goodman HM., Boyer HW. Specificity of substrate recognition by the EcoRI restriction endonuclease.. „Proc Natl Acad Sci U S A”. 02;72. 9, s. 3310-4, 1976. PMID 242001. 
  3. Gardner RC., Howarth AJ., Messing J., Shepherd RJ. Cloning and sequencing of restriction fragments generated by Eco RI*.. „DNA”. 05;1. 2, s. 109-15, 1983. PMID 6299666. 
  4. Barany F. The TaqI 'star' reaction: strand preferences reveal hydrogen-bond donor and acceptor sites in canonical sequence recognition.. „Gene”. 09;65. 2, s. 149-65, 1988. PMID 2842230. 
  5. George J., Blakesley RW., Chirikjian JG. Sequence-specific endonuclease Bam HI. Effect of hydrophobic reagents on sequence recognition and catalysis.. „J Biol Chem”. 09;255. 14, s. 6521-4, 1980. PMID 6248525. 
  6. Malyguine E., Vannier P., Yot P. Alteration of the specificity of restriction endonucleases in the presence of organic solvents.. „Gene”. 05;8. 2, s. 163-77, 1980. PMID 6244210. 

Bibliografia[edytuj | edytuj kod]