Aktywność star

Z Wikipedii, wolnej encyklopedii
Skocz do: nawigacja, szukaj

Aktywność star – własność enzymów restrykcyjnych polegająca na obniżeniu lub zaniku specyficzności ich działania, objawiająca się cięciem DNA w miejscach innych niż restrykcyjne[1]. Wraz ze spadkiem specyficzności, cięciu podlegają miejsca coraz bardziej różne od oryginalnej sekwencji restrykcyjnej. Nazwa zjawiska pochodzi od oznaczenia alternatywnej aktywności, w odróżnieniu od zwykłej, znakiem * (EcoRI* zamiast EcoRI)[1][2][3]. Obecnie produkowane są sztucznie rekombinowane enzymy ze zmniejszoną lub zniesioną aktywnością star.

Najczęstszy zanik specyficzności polega na cięciu sekwencji różniących się od restrykcyjnej jednym nukleotydem, cięciu sekwencji krótszych o nukleotydy początkowe[4].

Na pojawienie się aktywności star w reakcjach z udziałem enzymów restrykcyjnych ma wpływ wiele czynników (choć każdy z różną siłą i to zależnie od enzymu, np. EcoRI jest bardziej wrażliwy na podwyższone stężenie glicerolu niż na podwyższone pH[5]), między innymi:

Aktywność star jest zwykle zjawiskiem niepożądanym, utrudniającym i wprowadzającym zmienność do przeprowadzanego eksperymentu. Problem ten staje się wyraźny w przypadku reakcji z użyciem kilku enzymów restrykcyjnych naraz (cięcie wielokrotne), gdy trudne jest zapewnienie warunków optymalnych każdemu z nich.

Aktywność star można redukować stosując się do zaleceń producenta enzymów, takich jak:

  • używania enzymu w minimalnej ilości potrzebnej do pocięcia danej ilości DNA (zmniejsza ilość glicerolu w próbce oraz zapewnia odpowiedni stosunek enzymu do DNA, wydłuża jednak czas reakcji);
  • pozbycie się śladów odczynników organicznych (szczególnie etanolu używanego powszechnie do izolacji DNA);
  • zapewnienie odpowiednio wysokiej lub specjalne zawyżanie siły jonowej (niektóre enzymy są jednak inhibowane przez wysoką siłę jonową);
  • utrzymywanie pH reakcji w okolicach 7,0 (wyższe pH reakcji bywa efektem używania niewystarczająco czystego DNA izolowanego metodą lizy alkalicznej);
  • używanie Mg2+ jako jonów dwuwartościowych wspomagających pracę enzymu i unikanie zanieczyszczeń innymi jonami.

Przypisy

  1. 1,0 1,1 Nasri M., Thomas D. Relaxation of recognition sequence of specific endonuclease HindIII.. „Nucleic Acids Res”. 03;14. 2, s. 811-21, 1986. PMID: 3003698. 
  2. 2,0 2,1 2,2 Polisky B., Greene P., Garfin DE., McCarthy BJ., Goodman HM., Boyer HW. Specificity of substrate recognition by the EcoRI restriction endonuclease.. „Proc Natl Acad Sci U S A”. 02;72. 9, s. 3310-4, 1976. PMID: 242001. 
  3. Gardner RC., Howarth AJ., Messing J., Shepherd RJ. Cloning and sequencing of restriction fragments generated by Eco RI*.. „DNA”. 05;1. 2, s. 109-15, 1983. PMID: 6299666. 
  4. Barany F. The TaqI 'star' reaction: strand preferences reveal hydrogen-bond donor and acceptor sites in canonical sequence recognition.. „Gene”. 09;65. 2, s. 149-65, 1988. PMID: 2842230. 
  5. George J., Blakesley RW., Chirikjian JG. Sequence-specific endonuclease Bam HI. Effect of hydrophobic reagents on sequence recognition and catalysis.. „J Biol Chem”. 09;255. 14, s. 6521-4, 1980. PMID: 6248525. 
  6. Malyguine E., Vannier P., Yot P. Alteration of the specificity of restriction endonucleases in the presence of organic solvents.. „Gene”. 05;8. 2, s. 163-77, 1980. PMID: 6244210. 

Bibliografia[edytuj | edytuj kod]