Awidyna

Z Wikipedii, wolnej encyklopedii
Skocz do: nawigacji, wyszukiwania

Awidynabiałko składające się z czterech łańcuchów polipetydowych, masa ok. 70 kD, pI ok. 10 pH, obecne w jajach. Wykazuje duże powinowactwo do biotyny (Kd = 10-15 1/mol/l i jest to jedna z najmocniejszych zaobserwowanych w przyrodzie interakcji niekowalencyjnych. Jedna cząsteczka awidyny wiąże cztery cząsteczki biotyny. Kolumy z awidyną immobilizowaną na żelu polimetakrylowym znalazły zastosowanie do oczyszczania peptydów i białek. Występuje w tzw. białku jaj płazów i ptaków. Wiążąc biotynę, stymulującą namnażanie bakterii, chroni jaja przed zakażeniem. Spożywanie dużej ilości surowych jaj może doprowadzić do niedoboru biotyny [1].

Działanie biologiczne[edytuj | edytuj kod]

Awidyna to główna glikoproteina produkowana w jajowodzie ptaków, gadów i płazów, która jest gromadzona w białku ich jaj. W białku jaja kurzego awidyna stanowi około 0,05% ogólnej zawartości białek (w przybliżeniu 1,8 mg na jajko). Traktowana jest jako substancja antyodżywcza (antywitamina), gdyż bardzo silnie łączy się z biotyną (witaminą H) w jelicie przewodu pokarmowego. Niewłaściwe wchłanianie biotyny prowadzi do powstawania niedoborów tej witaminy w organizmie. Objawia się to: zapaleniem skóry i języka, łojotokiem, wypadaniem włosów, niedokrwistością, podwyższeniem poziomu cholesterolu, depresją, apatią, nadwrażliwością czuciową czy ogólnym osłabieniem. Przedłużająca się awitaminoza biotynowa jest przyczyną zmian skórnych, przede wszystkim zmian jej barwy i łuszczenia naskórka. U człowieka niedobór biotyny występuje rzadko. Obróbka cieplna unieczynnia awidynę, dlatego spożywanie ugotowanych jaj kurzych nie przeszkadza w prawidłowej gospodarce biotyny.

Struktura chemiczna cząsteczki biotyny (witaminy H)

Jako, że biotyna wchodzi w skład wielu koenzymów jej związanie przez awidynę może prowadzić do zahamowania wielu szlaków metabolicznych. Awidyna tym samym staje się specyficznym inhibitorem tych reakcji i czego efektem może być:

  • blokowanie procesu glukogenezy – biotyna jest grupą prostetyczną karboksylazy, która odpowiada za przenoszenie cząsteczki CO2 na cząsteczkę pirogronianu, czego produktem jest szczawiooctan; związanie biotyny przez awidynę uniemożliwia ten proces;
  • blokowanie otrzymywania malonylo-CoA w biosyntezie kwasów tłuszczowych – hamowanie działania karboksylazy acetylo-CoA;
  • blokowanie rozkładu leucyny – inhibicja karboksylacji β-metylokrotonylo-CoA

do β-metyloglutakonylo-CoA.

Budowa chemiczna[edytuj | edytuj kod]

To tetrameryczne białko składa się z czterech identycznych podjednostek (homotetramer), z których każda może wiązać jedną cząsteczkę biotyny (witamina H), charakteryzując się przy tym dużym stopniem powinowactwa i specyficzności. Stała dysocjacji kompleksu awidyny z biotyną wynosi Kd=10-15 M, jest to jedno z najmocniejszych znanych oddziaływań niekowalencyjnych.

W swojej tetramerycznej formie awidyna charakteryzuje się masą cząsteczkową w przedziale 66-69 kDa. 10% tej masy obejmuje część węglowodanową złożoną z 4-5 cząsteczek mannozy i trzech fragmentów N-acetyloglukozaminowych. Każdy łańcuch polipeptydowy składa się ze 128 reszt aminokwasów, w obrębie których występuje jeden mostek disulfidowy. W strukturze drugorzędowej wyróżnić można 1 α-helisę i 8 β-struktur. Łańcuchy polipeptydowe nie są związane z sobą wiązaniami kowalencyjnymi. Ze względu na dużą ilość zasadowych reszt aminokwasowych białko to wykazuje charakter zasadowy, a jego punkt izoelektryczny znajduje się przy pH 10.

Awidyna jest bardzo dobrze rozpuszczalna w wodzie i roztworach soli. Jest wysoce niestabilna w warunkach utleniających, szczególnie w obecności promieniowania elektromagnetycznego.

Awidyna została wyizolowana w trzech formach. Jedna z nich, nieglikozylowana forma awidyny, pochodzi z ogólnodostępnego produktu, jednakże nie ma dowodów czy forma ta występuje naturalnie czy też jest efektem procesów produkcyjnych.

Odkrycie awidyny[edytuj | edytuj kod]

Awidyna po raz pierwszy została wykryta przez Esmonda Emersona Snella (1914-2003). Droga do odkrycia rozpoczęła się wraz z obserwacją, że kurczęta na diecie złożonej z surowego białka jaja wykazują znaczny deficyt biotyny, pomimo dostarczania tej witaminy z pokarmem. Pozwoliło to na wyciągnięcie wniosku, że w białku jaja znajduje się składnik wiążący biotynę, który Snell potwierdził badając in vitro komórki drożdży. Później Snell wyizolował składnik białka jaja odpowiedzialny za wiązanie biotyny i we współpracy z Paulem Gyorgym udowodnił, że wyizolowana przez niego proteina jest odpowiedzialna za wywoływanie niedoborów biotyny oraz „egg white injury”. Białko to zostało wstępnie nazwane awidalbuminą (dosłownie: głodna albumina) przez zespół naukowców z Uniwersytetu Texas. Nazwa białka została w toku późniejszych badań zmieniona na Awidyna, w związku z jego wysokim powinowactwem do biotyny (awid + biotyna).

Zastosowanie awidyny[edytuj | edytuj kod]

Naukowcy w latach 70. pomogli umocnić pozycję kompleksu awidyna-biotyna jako skuteczne narzędzie w naukach biologicznych. Znając siłę i specyficzność oddziaływań w kompleksie awidyna-biotyna rozpoczęto próby wykorzystania awidyny jako sondy i matrycy o wysokim powinowactwie w wielu projektach badawczych. Niewiele później naukowcy, tacy jak Bayer i Wilchek, odkryli nowe metody i reagenty w procesie biotynylacji przeciwciał i innych biomolekuł, umożliwiając przeniesienie kompleksu awidyna-biotyna do zastosowania w obszarze biotechnologii. Obecnie awidyna jest szeroko wykorzystywana w badaniach i diagnostyce oraz w przyrządach medycznych i farmaceutykach.

Powinowactwo awidyny do biotyny znajduje zastosowanie wśród wielu analiz biochemicznych, w tym testach Western-blot, ELISA, ELISPOT oraz analizie typu pull-down (metoda in vitro, badająca fizyczne oddziaływania między dwoma lub więcej cząsteczkami białek). Awidyna immobilizowana na nośniku stałym jest również wykorzystywana w procesie oczyszczania jako środek wychwytujący znakowane biotyną przeciwciała, białka, receptory oraz cząsteczki kwasów nukleinowych.

Metody badawcze wykorzystujące właściwości kompleksu awidyna-biotyna:

  • Metoda izotopowych rozcieńczeń
  • Metoda ICAT (Isotope-Coded Affinity Tags)
  • Metody immunoenzymatyczne:
    • ABC (Avidin-Biotin Complex)
    • LAB (Labelled Avidin-Biotin)

Zmodyfikowane formy awidyny[edytuj | edytuj kod]

Jako glikoproteina o charakterze zasadowym awidyna może być wykorzystana do ukazania pewnych niespecyficznych oddziaływań w określonych warunkach środowiska. Neutrawidyna, deglikozylowana forma awidyny ze zmodyfikowanymi resztami argininy, wykazuje bardziej neutralną wartość pI. Jest ona wykorzystywana jako alternatywna w stosunku do natywnej formy awidyny, w przypadku której, problemy odnośnie badania różnego typu niespecyficznych oddziaływań rosną. Deglikozylowana neutralna forma awidyny jest dostępna na rynku w katalogach takich firm jak: Sigma-Aldrich (Extravidin), Thermo Scientific (NeutrAvidin), Invitrogen (NeutrAvidin) oraz Belovo (NeutraLiteTM).

Ze względu na nietypową siłę wiązania awidyna-biotyna, dysocjacja powstałego kompleksu wymaga ekstremalnych warunków, które prowadzą również do denaturacji proteiny. Nieodwracalna natura kompleksu awidyna-biotyna może powodować pewne ograniczenia w zastosowaniu tego układu w chromatografii powinowactwa, w której uwalnianie wychwyconego liganda jest cechą bardzo pożądaną. Naukowcom udało się stworzyć cząsteczkę awidyny, która wiązałaby biotynę w sposób odwracalny. Wykorzystali do tego modyfikację reszty tyrozyny (nitrowanie lub jodowanie), położonej w miejscu aktywnym tej proteiny. Zmodyfikowana awidyna charakteryzuje się silnym wiązaniem biotyny w pH 4, a uwolnienie związanej biotyny następuje w pH 10 i wyższym.

Monomeryczna forma awidyny ze zmniejszonym powinowactwem do biotyny, jest stosowana w wielu ogólnodostępnych żywicach wykorzystywanych w chromatografii powinowactwa. Monomeryczna awidyna powstaje w wyniku działania na immobilizowaną natywną awidynę mocznikiem lub chlorowodorkiem guanidyny (o stężeniu 6-8 M), uzyskuje się wówczas cząsteczkę o niższej stałej dysocjacji Kd=10-7M. Umożliwia to uwalnianie związanych cząsteczek z matrycy zawierającej awidynę w łagodniejszych warunkach, nie powodujących denaturacji, używając niskiego stężenia biotyny lub warunków niskiego pH.

Przypisy

  1. L. Sweetman, L. Surh, H. Baker, RM. Peterson i inni. Clinical and metabolic abnormalities in a boy with dietary deficiency of biotin.. „Pediatrics”. 68 (4), s. 553-8, Oct 1981. PMID 7322688. 

Bibliografia[edytuj | edytuj kod]

  • Rosano C., Arosio P., Bolognesi M., „The X-ray three-dimensional structure of avidin”, Biomolecular Engineering (1999) 16, 5-12.
  • Livnah O., Bayer E.A., Wilchek M., Sussman J.L., „Three-dimensional structures of avidin and the avidinbiotin complex” Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 5076-5080.

Linki zewnętrzne[edytuj | edytuj kod]

Zobacz też[edytuj | edytuj kod]

streptoawidyna