EcoRI
EcoRI (wym. "eko er jeden") - enzym, endonukleaza, wyizolowana po raz pierwszy ze szczepu RY13 E.coli[1], jest częścią bakteryjnego systemu modyfikacji restrykcyjnych.
W biologii molekularnej EcoRI jest używane jako enzym restrykcyjny. Przy cięciu DNA tworzy on lepkie końce[2] z przedłużonymi końcami 5'. Sekwencją rozpoznawaną i ciętą przez enzym jest palindromiczna sekwencja 5'-G▼AATTC-3' (nić komplementarna 3'-CTTAA▲G-5')[3].
Spis treści |
Struktura[edytuj]
Struktura przestrzenna enzymu została rozwiązana metodami rentgenograficznymi w 1986 roku[4].
Struktura pierwszorzędowa[edytuj]
EcoRI zawiera motyw PD..D/EXK, który jest miejscem aktywnym całej rodziny enzymów restrykcyjnych[5]. W EcoRI motyw ten zawiera reszty P90, D91, E111, A112, K113(2).
Struktura trzecio- i czwartorzędowa[edytuj]
Enzym składa się z jednej globularnej domeny z klasycznymi motywami α/β. Zawiera takżę pętlę, wystającą na zewnątrz, która owija się wokół DNA podczas jego wiązania.
Struktury krystaliczne ujawniły, że formą enzymu jest homodimer. Podczas wiązania DNA, obie jednostki oddziałują z nim symetrycznie. Wiązanie realizowane jest przez dwie alfa-helisy każdego monomeru, które formują czterohelisowy pęczek[6][7]. Za bezpośrednie współdziałanie obu homodimerów, odpowiedzialne są obecne w helisach reszty E144 i R145[8].
Zastosowania[edytuj]
Z powodu swojej selektywności i specyficznego miejsca cięcia, które następnie może ulec ligacji (zobacz też: ligaza), enzym ten jest używany w biologii molekularnej, szczególnie w technice klonowania, screeningów DNA, czy mutagenezy ukierunkowanej. Enzym ma skłonność wykazywania aktywności star przy podwyższonym pH i przy zbyt niskiej sile jonowej oraz podwyższonym stężeniu glicerolu[9]. Enzym wykazuje aktywność star bardziej przy podwyższonym stężeniu glicerolu niż przy podwyższonym pH[10].
Przypisy
- ↑ Roulland-Dussoix D., Boyer HW. The Escherichia coli B restriction endonuclease.. „Biochim Biophys Acta”. Nov 19;195. 1, s. 219-29, 1970. PMID 4901831.
- ↑ Mertz JE., Davis RW. Cleavage of DNA by R 1 restriction endonuclease generates cohesive ends.. „Proc Natl Acad Sci U S A”. 11 (69), s. 3370-4, listopad 1973. PMID 4343968.
- ↑ Dugaiczyk A., Hedgpeth J., Boyer HW., Goodman HM. Physical identity of the SV40 deoxyribonucleic acid sequence recognized by the Eco RI restriction endonuclease and modification methylase.. „Biochemistry”. Jan 29;13. 3, s. 503-12, 1974. PMID 4358949.
- ↑ McClarin JA., Frederick CA., Wang BC., Greene P., Boyer HW., Grable J., Rosenberg JM. Structure of the DNA-Eco RI endonuclease recognition complex at 3 A resolution.. „Science”. Dec 19;234. 4783, s. 1526-41, 1987. PMID 3024321.
- ↑ Pingoud A., Fuxreiter M., Pingoud V., Wende W. Type II restriction endonucleases: structure and mechanism.. „Cell Mol Life Sci”. 6 (62), s. 685-707, marzec 2005. doi:10.1007/s00018-004-4513-1. PMID 15770420.
- ↑ Heitman J. How the EcoRI endonuclease recognizes and cleaves DNA.. „Bioessays”. 7 (14), s. 445-54, lipiec 1992. doi:10.1002/bies.950140704. PMID 1445286.
- ↑ Pingoud A., Jeltsch A. Structure and function of type II restriction endonucleases.. „Nucleic acids research”. 18 (29), s. 3705–27, wrzesień 2001. PMID 11557805.
- ↑ Kurpiewski MR., Engler LE., Wozniak LA., Kobylanska A., Koziolkiewicz M., Stec WJ., Jen-Jacobson L. Mechanisms of coupling between DNA recognition specificity and catalysis in EcoRI endonuclease.. „Structure”. 10 (12), s. 1775–88, październik 2004. doi:10.1016/j.str.2004.07.016. PMID 15458627.
- ↑ Polisky B., Greene P., Garfin DE., McCarthy BJ., Goodman HM., Boyer HW. Specificity of substrate recognition by the EcoRI restriction endonuclease.. „Proc Natl Acad Sci U S A”. 9 (72), s. 3310-4, wrzesień 1976. PMID 242001.
- ↑ George J., Blakesley RW., Chirikjian JG. Sequence-specific endonuclease Bam HI. Effect of hydrophobic reagents on sequence recognition and catalysis.. „J Biol Chem”. 09;255. 14, s. 6521-4, 1980. PMID 6248525.
