EcoRI

Z Wikipedii, wolnej encyklopedii
Skocz do: nawigacja, szukaj
Struktura EcoRI

EcoRI (wym. "eko er jeden") - enzym, endonukleaza, wyizolowana po raz pierwszy ze szczepu RY13 E.coli[1], jest częścią bakteryjnego systemu modyfikacji restrykcyjnych.

W biologii molekularnej EcoRI jest używane jako enzym restrykcyjny. Przy cięciu DNA tworzy on lepkie końce[2] z przedłużonymi końcami 5'. Sekwencją rozpoznawaną i ciętą przez enzym jest palindromiczna sekwencja 5'-GAATTC-3' (nić komplementarna 3'-CTTAAG-5')[3].

Struktura[edytuj | edytuj kod]

Struktura przestrzenna enzymu została rozwiązana metodami rentgenograficznymi w 1986 roku[4].

Struktura pierwszorzędowa[edytuj | edytuj kod]

EcoRI zawiera motyw PD..D/EXK, który jest miejscem aktywnym całej rodziny enzymów restrykcyjnych[5]. W EcoRI motyw ten zawiera reszty P90, D91, E111, A112, K113(2).

Struktura trzecio- i czwartorzędowa[edytuj | edytuj kod]

Enzym składa się z jednej globularnej domeny z klasycznymi motywami α/β. Zawiera takżę pętlę, wystającą na zewnątrz, która owija się wokół DNA podczas jego wiązania.

Struktury krystaliczne ujawniły, że formą enzymu jest homodimer. Podczas wiązania DNA, obie jednostki oddziałują z nim symetrycznie. Wiązanie realizowane jest przez dwie alfa-helisy każdego monomeru, które formują czterohelisowy pęczek[6][7]. Za bezpośrednie współdziałanie obu homodimerów, odpowiedzialne są obecne w helisach reszty E144 i R145[8].

Zastosowania[edytuj | edytuj kod]

Z powodu swojej selektywności i specyficznego miejsca cięcia, które następnie może ulec ligacji (zobacz też: ligaza), enzym ten jest używany w biologii molekularnej, szczególnie w technice klonowania, screeningów DNA, czy mutagenezy ukierunkowanej. Enzym ma skłonność wykazywania aktywności star przy podwyższonym pH i przy zbyt niskiej sile jonowej oraz podwyższonym stężeniu glicerolu[9]. Enzym wykazuje aktywność star bardziej przy podwyższonym stężeniu glicerolu niż przy podwyższonym pH[10].

Przypisy

  1. Roulland-Dussoix D., Boyer HW. The Escherichia coli B restriction endonuclease.. „Biochim Biophys Acta”. Nov 19;195. 1, s. 219-29, 1970. PMID 4901831. 
  2. Mertz JE., Davis RW. Cleavage of DNA by R 1 restriction endonuclease generates cohesive ends.. „Proc Natl Acad Sci U S A”. 11 (69), s. 3370-4, listopad 1973. PMID 4343968. 
  3. Dugaiczyk A., Hedgpeth J., Boyer HW., Goodman HM. Physical identity of the SV40 deoxyribonucleic acid sequence recognized by the Eco RI restriction endonuclease and modification methylase.. „Biochemistry”. Jan 29;13. 3, s. 503-12, 1974. PMID 4358949. 
  4. McClarin JA., Frederick CA., Wang BC., Greene P., Boyer HW., Grable J., Rosenberg JM. Structure of the DNA-Eco RI endonuclease recognition complex at 3 A resolution.. „Science”. Dec 19;234. 4783, s. 1526-41, 1987. PMID 3024321. 
  5. Pingoud A., Fuxreiter M., Pingoud V., Wende W. Type II restriction endonucleases: structure and mechanism.. „Cell Mol Life Sci”. 6 (62), s. 685-707, marzec 2005. doi:10.1007/s00018-004-4513-1. PMID 15770420. 
  6. Heitman J. How the EcoRI endonuclease recognizes and cleaves DNA.. „Bioessays”. 7 (14), s. 445-54, lipiec 1992. doi:10.1002/bies.950140704. PMID 1445286. 
  7. Pingoud A., Jeltsch A. Structure and function of type II restriction endonucleases.. „Nucleic acids research”. 18 (29), s. 3705–27, wrzesień 2001. PMID 11557805. 
  8. Kurpiewski MR., Engler LE., Wozniak LA., Kobylanska A., Koziolkiewicz M., Stec WJ., Jen-Jacobson L. Mechanisms of coupling between DNA recognition specificity and catalysis in EcoRI endonuclease.. „Structure”. 10 (12), s. 1775–88, październik 2004. doi:10.1016/j.str.2004.07.016. PMID 15458627. 
  9. Polisky B., Greene P., Garfin DE., McCarthy BJ., Goodman HM., Boyer HW. Specificity of substrate recognition by the EcoRI restriction endonuclease.. „Proc Natl Acad Sci U S A”. 9 (72), s. 3310-4, wrzesień 1976. PMID 242001. 
  10. George J., Blakesley RW., Chirikjian JG. Sequence-specific endonuclease Bam HI. Effect of hydrophobic reagents on sequence recognition and catalysis.. „J Biol Chem”. 09;255. 14, s. 6521-4, 1980. PMID 6248525.