Elektroforeza

Z Wikipedii, wolnej encyklopedii
Skocz do: nawigacja, szukaj
Aparat do pionowej elektroforezy żelowej
Aparat do poziomej elektroforezy żelowej

Elektroforeza – technika analityczna, rzadziej preparatywna, stosowana w chemii i biologii molekularnej, zwłaszcza w genetyce. Jej istotą jest rozdzielenie mieszaniny związków chemicznych na możliwie jednorodne frakcje przez wymuszanie wędrówki ich cząsteczek w polu elektrycznym.

Cząsteczki różnych substancji różnią się zwykle ruchliwością elektroforetyczną. Parametr ten jest w przybliżeniu wprost proporcjonalny do ładunku elektrycznego cząsteczki i odwrotnie proporcjonalny do jej wielkości. Zależy także od kształtu cząsteczki.

Istnieje wiele wariantów tej techniki. W zależności od ośrodka, w którym następuje rozdział, wyróżnić można elektroforezę bibułową (dziś już przestarzałą i praktycznie nie używaną), żelową i kapilarną.

Elektroforeza żelowa[edytuj | edytuj kod]

W elektroforezie żelowej ośrodkiem, w którym przemieszczają się badane substancje, jest żel elektroforetyczny wykonany z agarozy, poliakrylamidów[1], agaru lub skrobi (metoda historyczna), uformowany w płytkę długości kilkunastu – kilkudziesięciu centymetrów i grubości od ułamka do kilku milimetrów (rzadziej jest to słupek – elektroforeza dyskowa). Kroplę analizowanej mieszaniny nanosi się w zagłębienie w żelu – studzienkę. Próbka rozpuszczona jest z reguły w roztworze o większej gęstości (np. w formamidzie), dzięki czemu rozpływa się na dnie studzienki, a po włączeniu zasilania migruje do żelu jako wąski prążek. W zależności od techniki, cały żel lub jego końce zanurzone są w przewodzącym prąd roztworze buforowym. Wzdłuż krawędzi żelu, zwykle na dwóch przeciwległych bokach płytki, biegną elektrody, do których przykłada się stałe lub asymetryczne pulsujące napięcie elektryczne rzędu 50-3000 V. Ze względu na zróżnicowaną mobilność elektroforetyczną, ruchliwsze (zazwyczaj mniejsze) cząsteczki oddalają się szybciej od miejsca naniesienia próbki. Przebieg elektroforezy można monitorować nanosząc (na osobnych ścieżkach lub razem z preparatem) specjalne barwniki (tzw. markery) o znanej mobilności elektroforetycznej.

Umieszczanie mieszaniny do elektroforezy w studzience.
Fragment żelu poliakrylamidowego z oligonukleotydami analizowanymi w świetle UV. Elektroforeza przebiegała od góry ku dołowi. Poszczególne ścieżki obrazują proces przyłączania barwnika fluorescencyjnego, co zmieniało mobilność oligomerów i ich właściwości spektroskopowe.
BP, XC – markery długości.
Ścieżki A – C: absorpcja przy 254 nm;
D: fluorescencja przy 366 nm

Po zakończeniu procesu żel wydobywa się z aparatu i analizuje przez wybarwienie bądź obserwację absorpcji światła (zazwyczaj UV) przez żel. Wizualizację elektroferogramów preparatów znakowanych izotopowo uzyskuje się przez zaczernienie kliszy fotograficznej (autoradiogram). W przypadku technik preparatywnych obszary żelu zawierające pożądany produkt wycina się i poddaje procesowi elucji.

Elektroforeza jest najczęściej stosowana do rozdzielania DNA, RNA lub białek wyekstrahowanych z komórek lub syntetycznych. Jest też czasami stosowana jako jedna z technik pomiaru masy cząsteczkowej i badania polidyspersji polimerów syntetycznych. Jeśli badaczowi zależy na ograniczeniu wpływu kształtu cząsteczek na szybkość ich elektroforetycznej wędrówki i na ściślejszym powiązaniu ich ruchliwości z masą cząsteczkową, to może badane substancje poddać denaturacji, np. przy pomocy detergentu SDS (w przypadku denaturacji białek) lub mocznika (w przypadku denaturacji DNA lub białek).

Z poziomu molekularnego elektroforeza polega na ukierunkowanym przesuwaniu analizowanych cząsteczek przez prąd i ich interakcji z fazą stałą żelu, która w tej cząsteczkowej skali wygląda jak przestrzenna sieć. Bardziej ruchliwe są mniejsze cząsteczki bo łatwiej się przeciskają przez tę sieć, większe się opóźniają. Pulsowy prąd uruchamia te które „utknęły” po drodze i daje lepszej jakości rozdział.

Przykładowe barwniki do nanoszenia próbek na żel

Przykładowe substancje wybarwiające DNA

Elektroforegram CE syntetycznego oligonukleotydu

Elektroforeza kapilarna[edytuj | edytuj kod]

Elektroforeza kapilarna (CE, od ang. Capillary Electrophoresis), zwana też elektroforezą w wolnym buforze służy najczęściej do rozdziału niewielkich cząsteczek (podobnie jak HPLC). Metoda ta jest często stosowana w biologii molekularnej do analizy DNA, znacznie rzadziej do rozdziału peptydów. Rozdział mieszanin prowadzony jest w cienkiej (wewn. średnica 25-100 µm) i długiej (0,5-1 m) kapilarze kwarcowej, przypominającej z wyglądu światłowód. Kapilara ta wypełniana jest buforem.

Próbka wprowadzana jest do wlotu kapilary, po czym jest do niej przykładane wysokie napięcie elektryczne (do 30 kV). U wylotu kapilary zamontowany jest detektor, który rejestruje wychodzenie z rurki kolejnych związków chemicznych. Bufor płynie przez kapilarę ze stałą szybkością w stronę jednej z elektrod. Dla układu wodnego jest to zwykle katoda.

Technika ta umożliwia rozdzielanie anionów i kationów soli organicznych i nieorganicznych.

Odmianą elektroforezy kapilarnej jest micelarna chromatografia elektrokinetyczna (MEKC). W tej technice w buforze rozdziałowym znajduje się rozpuszczony detergent jonowy (np. dodecylosiarczan sodu – SDS) w takim stężeniu, aby tworzyć trwałą emulsję. Emulsja ta składa się z miceli, które są hydrofobowe wewnątrz i naładowane elektrycznie na swojej powierzchni.

Micele te dzięki swemu ładunkowi poruszają się z inną prędkością niż reszta buforu, a w ich wnętrzach zamknięte są cząsteczki związków chemicznych tworzących analizowaną mieszaninę. Pozwala to rozdzielać związki chemiczne, które nie przyjmują ładunku elektrycznego nawet po przyłożeniu dużego napięcia. Metoda ta umożliwia rozdział i analizę niemal wszystkich związków chemicznych rozpuszczalnych w wodzie.

Zobacz też[edytuj | edytuj kod]

Przypisy

  1. Elektroforeza na żelu poliakrylamidowym oznaczana jest akronimem PAGE, z ang. PolyAcrylamide Gel Electrophoresis.