PCR z odwrotną transkryptazą

Z Wikipedii, wolnej encyklopedii
Skocz do: nawigacji, wyszukiwania

PCR z odwrotną transkryptazą (RT-PCR, z ang. reverse transcriptase PCR) – PCR, w którym pierwszy etap jest przeprowadzony przez odwrotną transkryptazę, a jako matryca służy cząsteczka mRNA.

Odwrotna transkrypcja[edytuj | edytuj kod]

Information icon.svg Osobny artykuł: Odwrotna transkrypcja.

Pierwszym krokiem w reakcji RT-PCR jest przeprowadzenie reakcji odwrotnej transkrypcji próbki zawierającej mRNA do cDNA. Stosuje się dwa rodzaje odwrotnych transkryptaz: pochodzącą z wirusa AMV (z ang. avian myeloblastosis virus) lub z wirusa MMLV (z ang. Moloney murine leukaemia virus). Do reakcji odwrotnej transkrypcji można użyć trzech rodzajów starterów:

  • specyficznych do danej sekwencji;
  • o przypadkowej sekwencji;
  • starterów zawierających końcach dużą liczbę tymin[1][2].

Reakcja PCR[edytuj | edytuj kod]

Przebieg reakcji PCR po otrzymaniu cDNA jest analogiczny do reakcji PCR, w którym próbki zawierają DNA. Jako polimerazę stosuje się polimerazę Taq[1].

Modyfikacja metody[edytuj | edytuj kod]

W sytuacji, gdy cząsteczka RNA zawiera dużo struktur II-rzędowych, możliwe jest użycie polimerazy Tth (one-enzyme/one-tube system). Polimeraza Tth posiada aktywność polimerazy DNA oraz odwrotnej transkryptazy, lecz nie ma aktywności RNAzy H. Główną wadą tej metody jest to, że nie jest ona tak czuła jak standardowa metoda[1][3].

Zastosowanie[edytuj | edytuj kod]

PCR z odwrotna transkryptazą należy do najbardziej czułych metod do wykrywania niewielkich ilości cząsteczkę mRNA w próbce. Pozwala to na wykorzystanie pojedynczej próbki do wielu eksperymentów. Dzięki RT-PCR możliwe jest określenie ilości cząsteczek mRNA pomiędzy różnymi próbkami, określenie poziomu ekspresji oraz analizy struktury RNA[1]. Praktycznie metodę RT-PCR wykorzystuje się w wykrywaniu enterowirusów w próbkach kału[4] oraz w detekcji wirusa HIV[5]. W 2009 roku na bazie RT-PCR opracowano metodę detekcji wirusa świńskiej grypy typu H1N1[6].

Linki zewnętrzne[edytuj | edytuj kod]

Bibliografia[edytuj | edytuj kod]

T. Brown: Genomy. Warszawa: Wydawnictwo Naukowe PWN, 2009, s. 671. ISBN 978-83-01-15634-3.

Przypisy