Reakcja łańcuchowa polimerazy

Z Wikipedii, wolnej encyklopedii
Skocz do: nawigacja, szukaj
Zestaw ośmiu probówek do PCR, każda zawiera 100 μl mieszaniny reakcyjnej.

Reakcja łańcuchowa polimerazy, PCR (z ang. polymerase chain reaction) – metoda powielania łańcuchów DNA polegająca na łańcuchowej reakcji polimerazy DNA w wyniku wielokrotnego podgrzewania i oziębiania próbki, w warunkach laboratoryjnych. Technika ta została wynaleziona w 1983 roku przez Kary'ego Mullisa z kalifornijskiej firmy Cetus, za co Mullis otrzymał w roku 1993 Nagrodę Nobla.

Znajduje ona wiele zastosowań, między innymi w badaniach nad genomem, charakteryzowaniu ekspresji genów, klonowaniu genów, diagnostyce klinicznej, identyfikacji osób zaginionych, kryminalistyce, paleontologii.

Składniki mieszaniny reakcyjnej[edytuj | edytuj kod]

Do reakcji doprowadza się:

  • matrycowy DNA, którego fragment ma być powielony
  • mieszankę nukleotydów (czyli trifosforanów deoksyrybonukleozydów)
  • startery (primery), czyli krótkie (zwykle około 20 nukleotydów) fragmenty DNA komplementarne do fragmentów matrycy znajdujących się na obu końcach interesującego nas genu. Wyróżniamy dwa typy starterów: starter przedni (forward)[1] – jego sekwencja musi być taka sama jak sekwencja powielana; starter wsteczny (reverse)[1] – jego sekwencja musi być komplementarna do powielanej.
  • termostabilną polimerazę DNA. Używanym do reakcji enzymem może być na przykład polimeraza Taq wyizolowana z bakterii Thermus aquaticus lub polimeraza Pfu z archeowców Pyrococcus furiosis. Polimeraza Pfu charakteryzuje się większą progresywnością niż Taq, jednakże działa wolniej. Dostępne są także inne polimerazy, będące z reguły modyfikacjami wyżej wymienionych.

Czasem dodaje się jeszcze inne składniki, na przykład roztwór tRNA (chroniący inne składniki mieszaniny przed adsorpcją na ściankach naczynia) lub barwniki i wskaźniki informujące o przebiegu reakcji (szczególnie w modyfikacjach PCR).

Przebieg reakcji[edytuj | edytuj kod]

Przebieg reakcji PCR

Reakcja PCR składa się z wielokrotnie powtarzanego cyklu trzech etapów, które zachodzą w rożnych temperaturach. Można zatem wymuszać je bez ingerencji w skład mieszaniny, a jedynie przez zmianę temperatury mieszaniny reakcyjnej.

  1. Denaturacja. Pierwszym etapem jest rozplecenie podwójnej helisy matrycowego DNA (lub mRNA, jeśli stanowi matrycę). W wysokiej temperaturze (zwykle około 95 °C) pękają wiązania wodorowe i podwójna helisa DNA rozdziela się na dwa pojedyncze łańcuchy. W celu uzyskania tego efektu podnosi się temperaturę mieszaniny reakcyjnej do wymaganych 95° na 15 sekund.
  2. Annealing – hybrydyzacja odcinków starterowych. Polega na tworzeniu odcinków dwuniciowych, składających się z przygotowanych starterów - cząsteczek DNA komplementarnych do sekwencji DNA oskrzydlających gen mający ulec namnożeniu - z matrycową cząsteczką DNA. Etap ten zachodzi w temperaturze niższej, ściśle określonej dla danej pary starterów (pomiędzy 45-60 °C), przyłączają się one do matrycy. Ponieważ roztwory primerów są dodawane w dużym nadmiarze w stosunku do matrycy, jest bardzo mało prawdopodobne, żeby na tym etapie, zamiast hybryd starter-matryca utworzyły się hybrydy połączonych się ze sobą dwóch nici matrycy.
  3. Elongacja – Na tym etapie zachodzi właściwa synteza DNA i tym samym amplifikacja pożądanego genu. Podwyższenie temperatury do około 72 °C powoduje utworzenie się na matrycy, z przyłączonymi do niej starterami, kompleksu z polimerazą DNA, wskutek czego rozpoczyna się synteza nici komplementarnej do matrycy. Reakcja ta trwa zwykle 30 sekund.

Następnie cykl powtarza się i w kolejnym etapie annealingu i elongacji jako matryca mogą służyć wszystkie zsyntetyzowane dotychczas cząsteczki genu. W ten sposób reakcja, dopóki substraty i enzym są w wystarczającej ilości, zachodzi coraz szybciej, powodując coraz większy przyrost kopii genu na etapie elongacji.

Gdyby wydajność metody była stuprocentowa, po n cyklach reakcji z jednej cząsteczki można by uzyskać 2n cząsteczek. W praktyce wydajność procesu jest mniejsza, co nie zmienia faktu, że metoda PCR pozwala na geometryczne zwielokrotnienie pożądanego łańcucha DNA. Konwencjonalna technika PCR pozwala na namnażanie łańcuchów DNA o maksymalnej długości ok. 10 kpz.

Modyfikacje PCR[edytuj | edytuj kod]

Elektroforeza zamplifikowanych fragmentów DNA. (1) Ojciec. (2) Dziecko. (3) Matka.

Stosuje się również modyfikacje metody PCR, między innymi:

  • RT-PCR (Reverse Transcription) modyfikacja polegająca na użyciu mRNA jako matrycy. Synteza DNA na matrycy mRNA odbywa się przy użyciu odwrotnej transkryptazy (RT). Następnie DNA namnaża się za pomocą zwykłej reakcji PCR. Metoda ta pozwala na amplifikację wyłącznie sekwencji zawartej w dojrzałym mRNA, a więc tylko egzonów. Powstały DNA określany jest jako cDNA – komplementarny DNA.
  • real time PCR – do środowiska reakcji wprowadzane są znakowane (np. barwnikami fluorescencyjnymi) nukleotydy bądź sondy łączące się z DNA, które pozwalają na podstawie odczytów w kolejnych cyklach określić ilość matrycy użytej do reakcji, jak również śledzić ilość powstającego produktu.
  • nested-PCR – stosowany gdy dysponuje się niewielką ilością matryc DNA. Jego istotą jest synteza kilku długich fragmentów zawierających interesujący nas fragment na początku reakcji (dzięki czemu powielamy nasz materiał badawczy) a dopiero w następnym kroku dodajemy startery okalające nasz badany odcinek.
  • RACE PCR – szybka amplifikacja końców cDNA ((ang.) Rapid Amplification of cDNA Ends PCR)
  • PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction – Restriction Fragment Length Polymorphism) – metoda wykorzystująca enzymy restrykcyjne w celu identyfikacji mutacji w obrębie miejsc cięcia danego enzymu. Pozwala też na wykrycie mutacji prowadzących do powstania nowych miejsc cięcia[2].
  • RG-PCR
  • ACRS-PCR
  • ARMS-PCR
  • ASA-PCR
  • PCR-ASO (Allele Specific Oligonucleotide) – metoda wykorzystująca hybrydyzację ze specyficznymi sondami oligonukleotydowymi, wykrywającymi mutacje znajdujące się poza miejscami restrykcyjnymi. Pozwala na rozpoznanie allelu dzikiego (prawidłowego) lub zmutowanego.
  • PCR-HD
  • PCR-SSCP – w technice tej obie nici poddaje się denaturacji, oraz pozwala im przyjąć właściwe dla sekwencji struktury przestrzenne. Zmiany obserwuje się na żelu. Technika ta może pozwolić na wykrycie różnych alleli danego genu[2].
  • PCR-DGGE
  • PCR-TGGE
  • inverse PCR (ITCR) – metoda wykorzystuje koliste cząsteczki DNA (powstałe w wyniku cięcia genomowego DNA enzymami restrykcyjnymi i ligowaniu tych fragmentów przez ligazę DNA pochodzącą z faga T4), które stanowią matrycę w reakcji PCR. Uzyskane produkty PCR są mniejsze niż odpowiednie produkty hydrolizy, ponieważ startery zostały zlokalizowane na koncach 5' i 3' sekwencji znanej, która ulega amplifikacji[3]
  • PCR-OLA
  • PCR-CCM
  • PCR-PTT
  • RAPD-PCR (losowa amplifikacja polimorficznego DNA) – metoda polega na użyciu jednego, krótkiego, losowego startera. Po zakończeniu reakcji i analizie elektroforetycznej otrzymuje się różnej długości prążki będące cechą charakterystyczną danego osobnika (fingerprinting). Niestety przez niską temperaturę łączenia starterów (konieczne by uzyskać wystarczającą ilość produktów) metoda ma niską powtarzalność, i wynik zależy od wielu trudnych do określenia czynników (np. niewielkie wahania temperatury, użyte odczynniki, czasy nagrzewania/chłodzenia)
  • REP-PCR (Repetitive sequence–based PCR) – jest to PCR z wykorzystaniem sekwencji repetytywnych. Metoda polega na wykorzystaniu w reakcji PCR starterów komplementarnych do sekwencji repetytywnych występujących w genomie. Produkty reakcji rozdzielane są na drodze elektroforezy w żelu agarozowym, tworząc swoisty wzór prążków, charakterystyczny dla danego szczepu bakterii. Metoda ma wysoką powtarzalność i ze względu na niski koszt i krótki czas, w porównaniu np. do reakcji Rea-PFGE może być stosowana do badania stopnia pokrewieństwa dużej liczby szczepów. Najczęściej stosowane są startery komplementarne do rodziny sekwencji BOX i ERIC[4]
  • QF-PCR (Quantitive Fluorescence PCR) – metoda opierająca się na wykorzystaniu, jako markerów, sekwencji krótkich powtórzeń tandemowych (STR). Startery do amplifikacji poszczególnych STR są znakowane fluorescencyjnie. QF-PCR znalazła zastosowanie w diagnostyce prenatalnej do oceny ilości kopii chromosomów 13, 18, 21, X i Y.

Zalety metody[edytuj | edytuj kod]

PCR jest bardzo użytecznym narzędziem w różnego typu badaniach genetycznych, ponieważ:

  • Nie wymaga znajomości sekwencji badanego genu – wystarczy znajomość sekwencji nukleotydów w odcinkach oskrzydlających gen.
  • Stosowane startery nie muszą być komplementarne do matrycy w 100%. Pozwala to na amplifikację wariantów tego samego genu, które różnią się od siebie niewielkimi zmianami w sekwencji.
  • Jednocześnie jest to metoda specyficzna – przy doborze odpowiednich starterów, powielaniu ulega tylko jeden odcinek DNA.
  • Jest to metoda bardzo czuła. Pozwala na wykrycie nawet pojedynczej cząsteczki DNA.

Przypisy

  1. 1,0 1,1 Polskie nazwy starterów wg Agnieszka Sok: Praca doktorska. Poznanie sekwencji genu białka wiążącego hormon juwenilny z Galleria mellonella (pol.). Politechnika Wrocławska. Wydziałowy Zakład Biochemii, 2007. [dostęp 2009-10-15]. s. 52.
  2. 2,0 2,1 Jakub Barylski: PCR – najpopularniejsza metoda badania DNA. IGM Internetowa Gazeta Medyczna nr 3, 7 lutego 2009. [dostęp 2011-08-31].
  3. H. Ochman, A. S. Gerber, D.L. Hartl. Genetic applications of the inverse polymerase chain reaction. „Genetics”. 120, s. 621-623, 1988. PMID 2852134. 
  4. Veraslovic J., Koeuth T., Lupski R.J. 1991. Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes. Nucleic Acids Res., 19(24): 6823-6831

Bibliografia[edytuj | edytuj kod]

Lubert Stryer, Jacek Augustyniak, Jan Michejda: Biochemia. Warszawa: Wydawnictwo Naukowe PWN, 2003. ISBN 83-01-13978-1.

Ryszard Słomski: Analiza DNA - teoria i praktyka. Poznań: Wydawnictwo Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu, 2008. ISBN 978-83-7160-496-6.

Zobacz też[edytuj | edytuj kod]

Commons in image icon.svg