EcoRV

Z Wikipedii, wolnej encyklopedii
Skocz do: nawigacji, wyszukiwania
Struktura EcoRV w kompleksie z dwuniciowym DNA

EcoRV (wym. "eko er pięć", ewentualnie "eko er fał") - enzym, endonukleaza restrykcyjna typu II, wyizolowana po raz pierwszy ze szczepu E.coli[1], jest częścią bakteryjnego systemu modyfikacji restrykcyjnych.

W biologii molekularnej EcoRV jest używane jako enzym restrykcyjny. Przy cięciu DNA tworzy tępe końce (patrz: lepkie końce). Sekwencją rozpoznawaną i ciętą przez enzym jest palindromiczna sekwencja 5'-GATATC-3' (nić komplementarna 3'-CTATAG-5')[2].

Struktura[edytuj | edytuj kod]

Struktura przestrzenna enzymu została rozwiązana metodami rentgenograficznymi w 1997 roku[3].

Struktura trzecio- i czwartorzędowa[edytuj | edytuj kod]

Rdzeń enzymu składa się z pięcioniciowych β-harmonijek flankowanych przez helisy-α. Motyw ten jest konserwatywnie zachowany we wszystkich innych restrykcyjnych endonukleazach typu II. W strukturze można także wyróżnić N-końcową subdomenę dimeryczną, utworzoną przez krótka helisę-α, dwuniciowe antyrównoległe β-harmonijki i długą α-helisę. Ta subdomena jest obecna wyłącznie w enzymach EcoRV i PvuII[4].

Działanie[edytuj | edytuj kod]

Podobnie do EcoRI, EcoRV tworzy homodimer zanim zwiąże się z DNA i rozpozna swoje miejsce cięcia[5]. Początkowo enzym słabo wiąże się do nici DNA, po czym zaczyna poruszać się w sposób losowy po nici, szukając rozpoznawanego miejsca restrykcyjnego[4]. EcoRV cechuje duża specyficzność w rozpoznawaniu sekwencji docelowej, szczególnio in vivo[2]. Po związaniu DNA w miejscu restrykcyjnym, enzym wymusza zmiany konformacyjne DNA, wyginając jego nić o jakieś 50°. W rezultacie rozluźnia to oddziaływania pomiędzy parami zasad, poszerza małą bruzde, a zacieśnia dużą bruzdę w cząsteczce DNA. To zbliża, podlegające cięciu, wiązania fosfodiestrowe do miejsca aktywnego enzymu. Samo cięcie nie wymaga hydrolizy ATP. EcoRV jest jedyną znaną restryktazą II typu wywołującą tak duże zmiany konformacyjne w DNA[4].

Zastosowania[edytuj | edytuj kod]

Z powodu swojej selektywności i specyficznego miejsca cięcia, które następnie może ulec ligacji (aczkolwiek z powodu tępych końców, mniej efektywnej) (zobacz też: ligaza), enzym ten jest używany w biologii molekularnej, szczególnie w technice klonowania. Enzym do poprawnej pracy wymaga dodania do buforu BSA [6].

Przypisy

  1. Kholmina GV., Rebentish BA., Skoblov IuS., Mironov AA., Iankovskiĭ NK. [Isolation and characteristics of the new site-specific endonuclease Eco RV]. „Dokl Akad Nauk SSSR”. 253. 2, s. 495-7, 1981. PMID 6253247. 
  2. 2,0 2,1 Taylor JD., Goodall AJ., Vermote CL., Halford SE. Fidelity of DNA recognition by the EcoRV restriction/modification system in vivo.. „Biochemistry”. Dec 4;29. 48, s. 10727-33, 1991. PMID 2176880. 
  3. Perona JJ., Martin AM. Conformational transitions and structural deformability of EcoRV endonuclease revealed by crystallographic analysis.. „J Mol Biol”. Oct 17;273. 1, s. 207-25, 1997. doi:10.1006/jmbi.1997.1315. PMID 9367757. 
  4. 4,0 4,1 4,2 Pingoud A., Jeltsch A. Structure and function of type II restriction endonucleases.. „Nucleic Acids Res”. Sep 15;29. 18, s. 3705-27, 2001. PMID 11557805. 
  5. Bitinaite J., Wah DA., Aggarwal AK., Schildkraut I. FokI dimerization is required for DNA cleavage.. „Proc Natl Acad Sci U S A”. Sep 1;95. 18, s. 10570-5, 1998. PMID 9724744. 
  6. Karta charakterystyki enzymu ze strony producenta (ang.)