EcoRV
EcoRV (wym. [eko er pięć], ewentualnie [eko er fał]) – endonukleaza restrykcyjna typu II, wyizolowana po raz pierwszy ze szczepu pałeczki okrężnicy[1], będąca częścią bakteryjnego systemu modyfikacji restrykcyjnych.
W biologii molekularnej enzym EcoRV jest używany jako restrykcyjny. Przy cięciu DNA tworzy końce tępe (czyli nie końce lepkie). Rozpoznawana i cięta przez enzym jest palindromowa sekwencja 5'-GAT▼ATC-3' (nić komplementarna 3'-CTA▲TAG-5')[2].
Struktura[edytuj | edytuj kod]
Struktura przestrzenna enzymu została rozwiązana metodami rentgenograficznymi w 1997 roku[3].
Struktura trzecio- i czwartorzędowa[edytuj | edytuj kod]
Rdzeń enzymu składa się z pięcioniciowych harmonijek beta flankowanych przez helisy alfa. Motyw ten jest konserwatywnie zachowany we wszystkich innych restrykcyjnych endonukleazach typu II. W strukturze można także wyróżnić N-końcową subdomenę dimeryczną, utworzoną przez krótka helisę α, dwuniciowe przeciwrównoległe harmonijki β i długą helisę α. Ta subdomena jest obecna wyłącznie w enzymach EcoRV i PvuII[4].
Działanie[edytuj | edytuj kod]
Podobnie do EcoRI, EcoRV tworzy homodimer, zanim zwiąże się z DNA i rozpozna swoje miejsce cięcia[5]. Początkowo enzym słabo wiąże się z nicią DNA, po czym zaczyna poruszać się po niej losowo, szukając rozpoznawanego miejsca restrykcyjnego[4]. EcoRV cechuje duża swoistość w rozpoznawaniu sekwencji docelowej, szczególnie in vivo[2]. Po związaniu DNA w miejscu restrykcyjnym enzym wymusza zmiany konformacyjne DNA, wyginając jego nić o około 50°. W rezultacie rozluźnia to oddziaływania między parami zasad, poszerza małą bruzdę, a zacieśnia dużą bruzdę w cząsteczce DNA. To zbliża, podlegające cięciu, wiązania fosfodiestrowe do miejsca aktywnego enzymu. Samo cięcie nie wymaga hydrolizy ATP. EcoRV jest jedyną znaną restryktazą II typu wywołującą tak duże zmiany konformacyjne w DNA[4].
Zastosowania[edytuj | edytuj kod]
Z powodu swojej selektywności i swoistego miejsca cięcia, które następnie może ulec ligacji (choć mniej efektywnej, z powodu końców tępych) (zob. ligaza), enzym ten jest używany w biologii molekularnej, szczególnie w technice klonowania. Enzym do poprawnej pracy wymaga dodania do buforu surowiczej albuminy wołowej[6].
Przypisy[edytuj | edytuj kod]
- ↑ Kholmina GV., Rebentish BA., Skoblov IuS., Mironov AA., Iankovskiĭ NK. [Isolation and characteristics of the new site-specific endonuclease Eco RV]. „Dokl Akad Nauk SSSR”. 253. 2, s. 495-7, 1981. PMID: 6253247.
- ↑ a b Taylor JD., Goodall AJ., Vermote CL., Halford SE. Fidelity of DNA recognition by the EcoRV restriction/modification system in vivo. „Biochemistry”. Dec 4;29. 48, s. 10727-33, 1991. PMID: 2176880.
- ↑ Perona JJ., Martin AM. Conformational transitions and structural deformability of EcoRV endonuclease revealed by crystallographic analysis.. „J Mol Biol”. Oct 17;273. 1, s. 207-25, 1997. DOI: 10.1006/jmbi.1997.1315. PMID: 9367757.
- ↑ a b c Pingoud A., Jeltsch A. Structure and function of type II restriction endonucleases.. „Nucleic Acids Res”. Sep 15;29. 18, s. 3705-27, 2001. PMID: 11557805.
- ↑ Bitinaite J., Wah DA., Aggarwal AK., Schildkraut I. FokI dimerization is required for DNA cleavage.. „Proc Natl Acad Sci U S A”. Sep 1;95. 18, s. 10570-5, 1998. PMID: 9724744.
- ↑ Karta charakterystyki enzymu ze strony producenta (ang.)