Sekwencjonowanie DNA: Różnice pomiędzy wersjami
| [wersja przejrzana] | [wersja przejrzana] |
m MalarzBOT: porządkowanie poziomów nagłówków |
|||
| Linia 7: | Linia 7: | ||
: gdzie: A – [[deoksyadenozyna]]; C – [[deoksycytydyna]]; G – [[deoksyguanozyna]]; T – [[tymidyna]] |
: gdzie: A – [[deoksyadenozyna]]; C – [[deoksycytydyna]]; G – [[deoksyguanozyna]]; T – [[tymidyna]] |
||
== Metody historyczne == |
|||
[[Plik:Sanger-DNA-seq.png|thumb|300px|Sekwencjonowania DNA metodą Sangera z użyciem znakowanych dideoksynukleotydów<br />'''A''' – przykładowa sekwencja DNA<br />'''B''' – przyłączenie startowego [[Oligonukleotydy|oligonukleotydu]] do nici matrycowej i kierunek syntezy DNA<br />'''C''' – produkty syntezy DNA, zakończone [[fluorescencja|fluorescencyjnie]] znakowanymi dideoksynukleotydami (kolorowe litery)<br />'''D''' – elektroforegram rozdziału otrzymanej mieszaniny fragmentów w [[elektroforeza#Elektroforeza kapilarna|elektroforezie kapilarnej]] wraz z zidentyfikowaną sekwencją (powyżej)]] |
[[Plik:Sanger-DNA-seq.png|thumb|300px|Sekwencjonowania DNA metodą Sangera z użyciem znakowanych dideoksynukleotydów<br />'''A''' – przykładowa sekwencja DNA<br />'''B''' – przyłączenie startowego [[Oligonukleotydy|oligonukleotydu]] do nici matrycowej i kierunek syntezy DNA<br />'''C''' – produkty syntezy DNA, zakończone [[fluorescencja|fluorescencyjnie]] znakowanymi dideoksynukleotydami (kolorowe litery)<br />'''D''' – elektroforegram rozdziału otrzymanej mieszaniny fragmentów w [[elektroforeza#Elektroforeza kapilarna|elektroforezie kapilarnej]] wraz z zidentyfikowaną sekwencją (powyżej)]] |
||
[[Plik:Pyrogram1.jpg|thumb|300px|Przykładowy pirogram uzyskany z pirosekwencjonowania]] |
[[Plik:Pyrogram1.jpg|thumb|300px|Przykładowy pirogram uzyskany z pirosekwencjonowania]] |
||
| Linia 14: | Linia 14: | ||
Autorem alternatywnej metody sekwencjonowania DNA, z wykorzystaniem specyficznej, chemicznej degradacji DNA, byli [[Walter Gilbert]] i [[Allan Maxam]] ([[metoda Maxama-Gilberta]])<ref>[http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pubmed&pubmedid=265521 A M Maxam and W Gilbert, ''A new method for sequencing DNA'', Proc Natl Acad Sci U S A. 1977 February; 74(2): 560–564.]</ref>. Gilbert wraz z [[Frederick Sanger|Frederickiem Sangerem]] otrzymali za to osiągnięcie [[Nagroda Nobla|nagrodę Nobla w dziedzinie chemii]]. Metoda Maxama-Gilberta obecnie jest rzadko stosowana. |
Autorem alternatywnej metody sekwencjonowania DNA, z wykorzystaniem specyficznej, chemicznej degradacji DNA, byli [[Walter Gilbert]] i [[Allan Maxam]] ([[metoda Maxama-Gilberta]])<ref>[http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pubmed&pubmedid=265521 A M Maxam and W Gilbert, ''A new method for sequencing DNA'', Proc Natl Acad Sci U S A. 1977 February; 74(2): 560–564.]</ref>. Gilbert wraz z [[Frederick Sanger|Frederickiem Sangerem]] otrzymali za to osiągnięcie [[Nagroda Nobla|nagrodę Nobla w dziedzinie chemii]]. Metoda Maxama-Gilberta obecnie jest rzadko stosowana. |
||
== Metody współczesne == |
|||
Obecnie odczyt sekwencji w metodzie Sangera został zautomatyzowany dzięki wykorzystaniu znakowanych [[fluorescencja|fluorescencyjnie]] trifosforanów dideoksynukleotydów i pozwala na odczyt 300-1000 par zasad z jednej [[kapilara|kapilary]] lub linii na [[żel]]u{{fakt|data=2010-03}}. |
Obecnie odczyt sekwencji w metodzie Sangera został zautomatyzowany dzięki wykorzystaniu znakowanych [[fluorescencja|fluorescencyjnie]] trifosforanów dideoksynukleotydów i pozwala na odczyt 300-1000 par zasad z jednej [[kapilara|kapilary]] lub linii na [[żel]]u{{fakt|data=2010-03}}. |
||
| Linia 23: | Linia 23: | ||
Nowoczesne metody sekwencjonowania DNA są na tyle tanie, iż setki tysięcy osób zapłaciły za zbadanie swojego DNA i wzięły udział w [[Projekt Genograficzny|Projekcie Genograficznym]]. Ta względna taniość umożliwiła również rozwój m.in. [[genetyka genealogiczna|genetyki genealogicznej]] oraz wielu rodzajów badań testujących obecność [[mutacje|mutacji]]. |
Nowoczesne metody sekwencjonowania DNA są na tyle tanie, iż setki tysięcy osób zapłaciły za zbadanie swojego DNA i wzięły udział w [[Projekt Genograficzny|Projekcie Genograficznym]]. Ta względna taniość umożliwiła również rozwój m.in. [[genetyka genealogiczna|genetyki genealogicznej]] oraz wielu rodzajów badań testujących obecność [[mutacje|mutacji]]. |
||
== Metody rozwojowe == |
|||
* [[pirosekwencjonowanie]]; jego wersja "sekwencjonowanie 454" pozwala odczytać 300 MBp na dzień w jednej maszynie. Metoda ta jest szczególnie przydatna do sekwencjonowania [[aDNA]]. |
* [[pirosekwencjonowanie]]; jego wersja "sekwencjonowanie 454" pozwala odczytać 300 MBp na dzień w jednej maszynie. Metoda ta jest szczególnie przydatna do sekwencjonowania [[aDNA]]. |
||
* bezpośredniego odczytu{{fakt|data=2010-03}}: |
* bezpośredniego odczytu{{fakt|data=2010-03}}: |
||
Wersja z 15:10, 2 paź 2014
Sekwencjonowanie DNA – technika odczytywania sekwencji, czyli kolejności par nukleotydowych w cząsteczce DNA.
Sekwencjonowanie dokonuje się obecnie głównie za pomocą zautomatyzowanych sekwencjonatorów. Manualne sekwencjonowanie stosuje się przy opracowywaniu nowatorskich metod, w niektórych laboratoriach dla krótkich fragmentów lub podczas ćwiczeń[potrzebny przypis].
- Przykład sekwencji DNA (początek operonu laktozowego E. coli z GenBank):
GACACCATCGAATGGCGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAAGAGAGTCAATTCAGGG
- gdzie: A – deoksyadenozyna; C – deoksycytydyna; G – deoksyguanozyna; T – tymidyna
Metody historyczne
A – przykładowa sekwencja DNA
B – przyłączenie startowego oligonukleotydu do nici matrycowej i kierunek syntezy DNA
C – produkty syntezy DNA, zakończone fluorescencyjnie znakowanymi dideoksynukleotydami (kolorowe litery)
D – elektroforegram rozdziału otrzymanej mieszaniny fragmentów w elektroforezie kapilarnej wraz z zidentyfikowaną sekwencją (powyżej)
Historyczną już i wypieraną metodą jest opracowana w 1977 r. metoda Sangera, oparta o syntezę DNA przez polimerazę DNA in vitro[1]. Do reakcji dodaje się niewielką ilość trifosforanów dideoksynukleotydów (ddNTP), które są wbudowywane w DNA, ale ich dołączenie uniemożliwia dalsze wydłużanie nici. W ten sposób otrzymuje się fragmenty DNA o różnej długości zakończone specyficznym nukleotydem. Produkty reakcji rozdziela się elektroforetycznie, co powoduję ich segregację pod względem wielkości.
Autorem alternatywnej metody sekwencjonowania DNA, z wykorzystaniem specyficznej, chemicznej degradacji DNA, byli Walter Gilbert i Allan Maxam (metoda Maxama-Gilberta)[2]. Gilbert wraz z Frederickiem Sangerem otrzymali za to osiągnięcie nagrodę Nobla w dziedzinie chemii. Metoda Maxama-Gilberta obecnie jest rzadko stosowana.
Metody współczesne
Obecnie odczyt sekwencji w metodzie Sangera został zautomatyzowany dzięki wykorzystaniu znakowanych fluorescencyjnie trifosforanów dideoksynukleotydów i pozwala na odczyt 300-1000 par zasad z jednej kapilary lub linii na żelu[potrzebny przypis].
Nowoczesne masowo równoległe aparaty do sekwencjonowania DNA są w stanie pracować z szybkością rzędu milionów par zasad na godzinę[potrzebny przypis]. Tranzystory polowe DNA umożliwiają użycie natywnego DNA w hybrydyzacji do mikromacierzy i odczyt w czasie rzeczywistym.
Nagroda Archon Genomics X PRIZE w wysokości 10 mln dolarów czeka na ośrodek, który będzie w stanie zsekwencjonować 100 genomów ludzkich w ciągu 10 dni[3]. Pierwsze sekwencjonowanie genomu człowieka zajęło wiele lat (zob. Projekt poznania ludzkiego genomu).
Nowoczesne metody sekwencjonowania DNA są na tyle tanie, iż setki tysięcy osób zapłaciły za zbadanie swojego DNA i wzięły udział w Projekcie Genograficznym. Ta względna taniość umożliwiła również rozwój m.in. genetyki genealogicznej oraz wielu rodzajów badań testujących obecność mutacji.
Metody rozwojowe
- pirosekwencjonowanie; jego wersja "sekwencjonowanie 454" pozwala odczytać 300 MBp na dzień w jednej maszynie. Metoda ta jest szczególnie przydatna do sekwencjonowania aDNA.
- bezpośredniego odczytu[potrzebny przypis]:
- nanosekwencjonowanie. Przesuwająca się cząsteczka DNA poprzez centrum aktywne modyfikowanych polimeraz jest odczytywana bezpośrednio. Szybkość takiego odczytu może dochodzić od 300 Bp/s dla pojedynczego nanometrowego czujnika[4].
- mikroskopowe
Historia rozwoju metod sekwencjonowania DNA
- 1953 – opracowanie modelu podwójnej helisy DNA przez Jamesa Watsona i Francisa Cricka
- 1972 – opracowanie sposobów izolacji materiału do dalszych badań. Rozwój technologii rekombinacji umożliwiający izolację dowolnych fragmentów DNA i ich replikację.
- 1977 – Allan Maxam i Walter Gilbert ogłaszają publikację pt. Sekwencjonowanie DNA przez chemiczną degradację. W tym samym czasie Sanger opublikował też metodę sekwencjonowania DNA przez syntezę katalizowaną enzymatycznie.
- 1980 – Fred Sanger i Walter Gilbert otrzymali nagrodę Nobla
- 1982 – utworzono Genbank – publicznie dostępną bazę danych sekwencji DNA
- Andre Marion i Samuel Eletr utworzyli firmę Applied Biosystems, która w tym okresie zdominowała automatyczne sekwencjonowanie DNA
- 1982 – Akiyoshi Wada zbudował roboty sekwencyjne dla firmy Hitachi.
- 1984 – badacze z MRC odczytali kompletną sekwencję wirusa Epstein-Barr, 170 kb.
- 1997 – zsekwencjonowano 5Mb genom bakterii Escherichia coli.
- 2001, 15 lutego – Konsorcjum HUGO opublikowało sekwencję genomu ludzkiego w Nature.
- 2001, 16 lutego – firma Celera Genomics opublikowała sekwencję genomu ludzkiego w Science.
Zobacz też
- ↑ Sanger, F, Nicklen, S, Coulson, AR. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. „Proc Natl Acad Sci U S A”. 74. 12, s. 5463–5467, 1977. PMID 431765.
- ↑ A M Maxam and W Gilbert, A new method for sequencing DNA, Proc Natl Acad Sci U S A. 1977 February; 74(2): 560–564.
- ↑ ogłoszenie o konkursie X Prize Foundation (ang.)
- ↑ Home