Western blot

Z Wikipedii, wolnej encyklopedii
Skocz do: nawigacja, szukaj
Przykładowy western blot – ekspozycja na kliszy fotograficznej z wykorzystaniem drugorzędowych przeciwciał skoniugowanych z peroksydazą chrzanową katalizującą reakcję luminescencyjną
Diagram prezentujący metodę western blot

Western blot – stosowana w biologii molekularnej metoda służąca do wykrywania określonych białek.

Metodą tą rozdziela się zdenaturowane białka według ich mas oraz naturalne (niezdenaturowane) białka według ich struktury przestrzennej, za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym[1]. Później białka są przenoszone na membranę (zwykle nitrocelulozową lub PVDF). Obecność odpowiednich białek sprawdza się za pomocą barwników – którymi mogą być pąs S (ponceau S), czerń amidowa lub błękit brylantowy Coomassie (Coomassie brilliant blue), inaczej kumazyna – albo przeciwciał przyłączających się do ich epitopów.

Przed dodaniem przeciwciał membrana zostaje „zablokowana” przez zanurzenie w roztworze innego białka, zwykle żelatyny, albuminy surowicy krwi bydlęcej lub odtłuszczonego mleka w proszku, często z dodatkiem detergentu (na przykład Tween 20) lub w roztworze samego detergentu, w celu uniemożliwienia nieswoistego łączenia się przeciwciał z membraną.

Analogicznie do metody ELISA w metodzie western blot można używać jednego przeciwciała związanego ze znacznikiem (metoda bezpośrednia) lub dwóch rodzajów przeciwciał: nieznakowanego, przeciwko wykrywanemu białku (przeciwciała pierwszorzędowe) oraz znakowanego, przeciwko danemu izotypowi immunoglobulin (przeciwciała drugorzędowe; metoda pośrednia).

Przeciwciała są znakowane zwykle enzymem (na przykład peroksydazą chrzanową lub fosfatazą alkaliczną), barwnikiem fluorescencyjnym (żargonowo zwanym fluorochromem) lub izotopem radioaktywnym. Przy znakowaniu enzymem używa się substratów dających barwny, nierozpuszczalny produkt osadzający się na membranie lub luminescencję. W przypadku wizualizacji przez luminescencję lub izotopy obraz otrzymuje się przez przyłożenie membrany do kliszy fotograficznej.

W diagnostyce wirusowego zapalenia wątroby typu C metodą tą wykrywa się rdzeń wirusa[2].

Przypisy

  1. Jakub Barylski: Technika Western blot i jej zastosowanie w diagnostyce. [dostęp 2011-10-14].
  2. Jeremy Mark Berg, John L Tymoczko, Lubert Stryer: Biochemia. Warszawa: Wydawnictwo Naukowe PWN, 2005, s. 103. ISBN 83-01-14379-7.