Western blot

Z Wikipedii, wolnej encyklopedii
Skocz do: nawigacja, szukaj
Przykładowy western blot – ekspozycja na kliszy fotograficznej z wykorzystaniem drugorzędowych przeciwciał skoniugowanych z peroksydazą chrzanową katalizującą reakcję luminescencyjną.
Diagram prezentujący metodę western blot

Western blot – stosowana w biologii molekularnej metoda służąca do wykrywania określonych białek.

Metodą tą rozdziela się zdenaturowane białka według ich mas oraz naturalne (niezdenaturowane) białka według ich struktury przestrzennej, za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym[1]. Później białka są przenoszone na membranę (zwykle nitrocelulozową lub PVDF). Obecność odpowiednich białek sprawdza się za pomocą barwników – którymi mogą być pąs S (ponceau S), czerń amidowa lub błękit brylantowy Coomassie (Coomassie brilliant blue), zwany kumazyną – albo przeciwciał przyłączających się do ich epitopów.

Przed dodaniem przeciwciał membrana zostaje „zablokowana” przez zanurzenie w roztworze innego białka, zwykle żelatyny, albuminy surowicy krwi bydlęcej (BSA) lub odtłuszczonego mleka w proszku, często z dodatkiem detergentu (np. Tween 20) lub w roztworze samego detergentu, w celu uniemożliwienia niespecyficznego łączenia się przeciwciał z membraną.

Analogicznie do metody ELISA w metodzie western blot można używać jednego przeciwciała związanego ze znacznikiem (metoda bezpośrednia) lub dwóch rodzajów przeciwciał: nieznakowanego, przeciwko wykrywanemu białku (przeciwciała pierwszorzędowe) oraz znakowanego, przeciwko danemu izotypowi immunoglobulin (przeciwciała drugorzędowe; metoda pośrednia).

Przeciwciała są znakowane zwykle enzymem (np. peroksydazą chrzanową lub fosfatazą alkaliczną), fluorochromem lub izotopem radioaktywnym. W przypadku znakowania enzymem używa się substratów dających barwny, nierozpuszczalny produkt osadzający się na membranie lub luminescencję. W przypadku wizualizacji przez luminescencję lub izotopy obraz otrzymuje się przez przyłożenie membrany do kliszy fotograficznej.

W diagnostyce wirusowego zapalenia wątroby typu C metodą tą wykrywa się rdzeń wirusa[2].

Przypisy

  1. Jakub Barylski: Technika Western blot i jej zastosowanie w diagnostyce. [dostęp 2011-10-14].
  2. Jeremy Mark Berg, John L Tymoczko, Lubert Stryer: Biochemia. Warszawa: Wydawnictwo Naukowe PWN, 2005, s. 103. ISBN 83-01-14379-7.