Blotting DNA

Z Wikipedii, wolnej encyklopedii
Skocz do: nawigacji, wyszukiwania

Blotting DNA – transfer DNA z żelu agarozowego lub żelu poliakrylamidowego na membranę (filtr) hybrydyzacyjną najczęściej w celu hybrydyzacji z sondą, będącą znakowanym jednoniciowym DNA komplementarnym do badanej sekwencji w próbie[1].

Membrany (filtry) hybrydyzacyjne[edytuj | edytuj kod]

Membrana hybrydyzacyjna wykonana jest najczęściej z nitrocelulozy lub nylonu. Na membranie celulozowej można wykonać hybrydyzację jednokrotnie (rzadko więcej niż jeden raz), a na membranie nylonowej – wielokrotnie (po usunięciu sondy użytej w pierwszej hybrydyzacji). Poza tym membrana nylonowa jest mniej krucha i nie wymaga zwilżania przed nałożeniem próby[2].

Elektroforeza[edytuj | edytuj kod]

Wykonuje się ją w żelu agarozowym o stężeniu około 0,8–1,5%[3]. Dla dsDNA i dsRNA wykonuje się ją w warunkach denaturujących, tak by otrzymać formy jednoniciowe, które są wymagane do hybrydyzacji. Elektroforeza służy rozdzieleniu przestrzennemu cząsteczek kwasów nukleinowych według ich ładunku i masy, a więc ich wielkości.

Transfer na membranę[edytuj | edytuj kod]

W praktyce laboratoryjnej najczęściej wykorzystuje się następujące metody[4]:

  • transfer kapilarny (wykorzystuje on siły kapilarne, jest to najstarsza metoda transferu)
  • transfer próżniowy (wykorzystuje podciśnienie wywołane próżnią przykładaną pod membranę)
  • elektrotransfer (wykorzystuje przepływ ładunków elektrycznych na tej samej zasadzie co elektroforeza).

Utrwalanie próby[edytuj | edytuj kod]

Po transferze z żelu DNA jest wiązany z membraną przez naświetlanie UV (membrana nylonowa) albo zapieczenie w mikrofalówce lub suszarce (membrana nitrocelulozowa)[5].

Zobacz też[edytuj | edytuj kod]

Przypisy

  1. F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J.A. Smith, K. Struhl: Current protocols in molecular biology. Chapter 2, Section IV, Unit 2.10. Willey & Sons, 2003. ISBN 047150338X.
  2. F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J.A. Smith, K. Struhl: Current protocols in molecular biology. Chapter 2, Section IV, Units 2.9A. Willey & Sons, 2003. ISBN 047150338X.
  3. F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J.A. Smith, K. Struhl: Current protocols in molecular biology. Chapter 2, Section II, Unit 2.5A. Willey & Sons, 2003. ISBN 047150338X.
  4. Dartmouth College, Cheung Lab, lab protocols Southern with DIG Probe.
  5. F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J.A. Smith, K. Struhl: Current protocols in molecular biology. Chapter 2, Section IV, Unit 2.9A. Willey & Sons, 2003. ISBN 047150338X.