Aptasensor

Aptasensor – rodzaj biosensora, którego część bioreceptorową tworzą aptamery oparte na kwasach nukleinowych^[1].

Aptamery w przeciwieństwie do często stosowanych w biosensorach przeciwciał, wykazują wysokie powinowactwo (wysoka stała wiązania) i specyficzność (stuprocentowa możliwość oznaczenia jednego składnika wobec innych, w złożonej próbce) do ściśle określonych biomolekuł lub cząsteczek organicznych^[2]. Ponadto aptamery mają niską podatność na denaturację, są tańsze od przeciwciał oraz można je łatwo modyfikować w celu ułatwienia adsorpcji na podłożu używanym w danym sensorze. Dla substancji, które nie wywołują silnych odpowiedzi immunologicznych trudno jest dobrać i wytworzyć odpowiednie przeciwciała. Aptamery z kolei mogą być opracowane dla dowolnej molekuły^[3]. Dodatkowo oligonukleotydy mają zdolność do oddziaływania z jonami i małymi cząsteczkami, które nie są rozpoznawane przez przeciwciała.

Tworzenie warstw aptamerowych

Adsorpcja

Adsorpcja jest najprostszą techniką immobilizacji łańcuchów DNA, z uwagi na to, że nie wymaga modyfikacji cząsteczek kwasów nukleinowych. Unieruchomienie polega na interakcjach jonowych zachodzących pomiędzy ujemnie naładowanymi łańcuchami DNA, a dodatnio naładowaną powierzchnią. Adsorpcję negatywnie naładowanych cząsteczek można stosować na elektrodach węglowych i grafitowych^[4].

Główną wadą takiego sposobu tworzenia warstwy jest możliwość desorpcji aptameru z powierzchni elektrody podczas hybrydyzacji oraz oddziaływanie DNA z powierzchnią elektrody w wielu miejscach łańcucha, co znacząco pogarsza wydajność hybrydyzacji^[5].

Metoda kowalencyjna

Podejście to polega na wiązaniu cząsteczek apatamerów z powierzchnią elektrody wiązaniem kowalencyjnym. W tym celu wykorzystuje się elektrody wykonane ze złota.

W celu utworzenia warstwy aptamerowej kowalencyjnie związanej z powierzchnią elektrody złotej konieczne jest zmodyfikowanie nici DNA krótkimi fragmentami tiolowymi na 3' bądź 5' końcu. Zazwyczaj stosuje się do tego łączniki o łańcuchu składającym się z 3 lub 6 atomów węgla. Tak utworzone cząsteczki oddziałują z powierzchnią złotą tworząc wiązania kowalencyjne pomiędzy atomami siarki tiolowanego DNA, a złotem z powierzchni^[6].

R−SH + Au → RS−Au + e−
+ H+

Proces wiązania polega na zanurzeniu powierzchni, która ma być zmodyfikowana w rozcieńczonym roztworze zmodyfikowanego aptameru. Na jakość uzyskanej monowarstwy wpływa stężenie roztworu immobilizującego, czas osadzania, rodzaj związku siarki, temperatura oraz czystość powierzchni.

Ze względu na swoją długość, zmodyfikowane cząsteczki DNA oddziałują z powierzchnią złotą także w sposób niespecyficzny. Aby zapobiec takiej sytuacji, stosuje się związki, które wypełniają wolne przestrzenie pomiędzy łańcuchami kwasów nukleinowych. Najczęściej stosowanym odczynnikiem jest 6-merkapto-1-heksanol, HS(CH
2)
6OH^[7]. Taka operacja zapewnia uformowanie się uporządkowanej warstwy, w której cząsteczki DNA oddziaływają z powierzchnią jedynie za pomocą wytworzonych wcześniej wiązań kowalencyjnych oraz zapewnia swobodne oddziaływanie łańcuchów aptamerowych z docelowymi molekułami^[8].

Powinowactwo awidyna/streptawidyna – biotyna

Sposób wiązania DNA do powierzchni za pomocą oddziaływań awidyny z biotyną polega na modyfikowaniu powierzchni elektrody pochodną awidyny bądź streptawidyny, a nici DNA biotyną, przyłączając ją kowalencyjnie. Biotyna wiąże się z bardzo wysokim powinowactwem z awidyną lub streptawidyną (K_a = 10¹⁵ M⁻¹)^[9]. Są one białkami tetrametrycznymi, zbudowane są z 4 podjenostek zawierających identyczne miejsca wiązania biotyny, co skutkuje uzyskiwaniem większych gęstości powierzchniowych DNA na tak zmodyfikowanej elektrodzie. Warstwa biosensorów uzyskana w ten sposób ma porównywalną stabilność i trwałość do tej uzyskanej metodą kowalencyjną.

Rodzaje elementów przetwornikowych

Optyczny

Długie aptamery ulegają zmianie konformacyjnej po wprowadzeniu próbki docelowej. Jeżeli do aptameru zostaną przyłączone cząsteczki sygnalizacyjne (np. fluorescencyjne), to pozwala to na detekcję optyczną zdarzenia wiązania cząsteczki. Aptasensor zmodyfikowany cząsteczką fluorescencyjną został np. wykorzystany do wykrywania L-argininoamidu (amidowej pochodnej L-argininy)^[10].

Elektrochemiczny

Ze względu na łatwość wytwarzania i prostą integrację miniaturowych ogniw elektrochemicznych z urządzeniami typu lab-on-a-chip, detekcja elektrochemiczna stała się częstym rozwiązaniem w bioczujnikach aptamerowych. Umożliwia jednoczesne wykrywanie wielu analitów na prostej, szybkiej i niedrogiej platformie. Zazwyczaj układ stosowany do detekcji elektrochemicznej składa się z elektrody roboczej, elektrody odniesienia oraz elektrody pomocniczej^[11].

Detekcja elektrochemiczna została zastosowana na kilka sposobów. Niektóre z nich obejmują katalizatory nieorganiczne lub organiczne, enzymy, enzymy redoks, czy nanocząstki złota. Aptasensor może również wykorzystywać znaczniki elektroaktywne, takie jak ferrocen^[12], czy błękit metylenowy^[13].

Metodami elektrochemicznymi wykorzystywanymi do takiej detekcji są m.in. woltamperometria cykliczna (CV), woltamperometria pulsowa różnicowa (DPV) i elektrochemiczna spektroskopia impedancyjna (EIS).

Wrażliwy na zmianę masy

Do elementów przetwornikowych czułych na zmianę masy, które stosowane są w aptasensorach należą między innymi powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR)^[14] oraz mikrowaga kwarcowa (QCM)^[15].

Przypisy

↑ Y.C.Y.C. Lim Y.C.Y.C., A.Z.A.Z. Kouzani A.Z.A.Z., W.W. Duan W.W., Aptasensors: A Review, „Journal of Biomedical Nanotechnology”, 6 (2), 2010, s. 93–105, DOI: 10.1166/jbn.2010.1103 [dostęp 2022-04-12] (ang.).
↑ TiborT. Hianik TiborT., JosephJ. Wang JosephJ., Electrochemical Aptasensors – Recent Achievements and Perspectives, „Electroanalysis”, 21 (11), 2009, s. 1223–1235, DOI: 10.1002/elan.200904566 [dostęp 2022-04-12] (ang.).
↑ Kyung-MiK.M. Song Kyung-MiK.M., SeonghwanS. Lee SeonghwanS., ChangillCh. Ban ChangillCh., Aptamers and Their Biological Applications, „Sensors”, 12 (1), 2012, s. 612–631, DOI: 10.3390/s120100612, ISSN 1424-8220, PMID: 22368488, PMCID: PMC3279232 [dostęp 2022-04-12] (ang.).
↑ Adeline HuilingA.H. Loo Adeline HuilingA.H., AlessandraA. Bonanni AlessandraA., MartinM. Pumera MartinM., An insight into the hybridization mechanism of hairpin DNA physically immobilized on chemically modified graphenes, „The Analyst”, 138 (2), 2013, s. 467–471, DOI: 10.1039/C2AN36199J, ISSN 0003-2654 [dostęp 2022-04-25] (ang.).
↑ MM. Pividori MM., Electrochemical genosensor design: immobilisation of oligonucleotides onto transducer surfaces and detection methods, „Biosensors and Bioelectronics”, 15 (5–6), 2000, s. 291–303, DOI: 10.1016/S0956-5663(00)00071-3 [dostęp 2022-04-26] (ang.).
↑ AudreyA. Sassolas AudreyA., Béatrice D.B.D. Leca-Bouvier Béatrice D.B.D., Loïc J.L.J. Blum Loïc J.L.J., DNA Biosensors and Microarrays, „Chemical Reviews”, 108 (1), 2007, s. 109–139, DOI: 10.1021/cr0684467, ISSN 0009-2665 [dostęp 2022-04-12] (ang.).
↑ EmilE. Paleček EmilE., MartinM. Bartošík MartinM., Electrochemistry of Nucleic Acids, „Chemical Reviews”, 112 (6), 2012, s. 3427–3481, DOI: 10.1021/cr200303p, ISSN 0009-2665 [dostęp 2022-04-12] (ang.).
↑ J. ChristopherJ.Ch. Love J. ChristopherJ.Ch. i inni, Self-Assembled Monolayers of Thiolates on Metals as a Form of Nanotechnology, „Chemical Reviews”, 105 (4), 2005, s. 1103–1170, DOI: 10.1021/cr0300789, ISSN 0009-2665 [dostęp 2022-04-12] (ang.).
↑ Noemi de-los-Santos-Alvarez i inni, Electrocatalytic Oxidation of NADH by Oxidized s-Adenosyl-L-Methionine (SAMe): Application to NADH and SAMe Determinations, „Electroanalysis”, 16 (11), 2004, s. 881–887, DOI: 10.1002/elan.200302892, ISSN 1040-0397 [dostęp 2022-04-12] (ang.).
↑ HiroakiH. Ozaki HiroakiH. i inni, Biomolecular sensor based on fluorescence-labeled aptamer, „Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters”, 16 (16), 2006, s. 4381–4384, DOI: 10.1016/j.bmcl.2006.05.054 [dostęp 2022-04-12] (ang.).
↑ Abd-ElgawadA.E. Radi Abd-ElgawadA.E., Maha RagaaM.R. Abd-Ellatief Maha RagaaM.R., Electrochemical Aptasensors: Current Status and Future Perspectives, „Diagnostics”, 11 (1), 2021, s. 104, DOI: 10.3390/diagnostics11010104, ISSN 2075-4418, PMID: 33440751, PMCID: PMC7828092 [dostęp 2022-04-26] (ang.).
↑ MònicaM. Mir MònicaM., IoanisI. Katakis IoanisI., Aptamers as elements of bioelectronic devices, „Molecular BioSystems”, 3 (9), 2007, s. 620, DOI: 10.1039/b708858b, ISSN 1742-206X [dostęp 2022-04-12] (ang.).
↑ Brian R.B.R. Baker Brian R.B.R. i inni, An Electronic, Aptamer-Based Small-Molecule Sensor for the Rapid, Label-Free Detection of Cocaine in Adulterated Samples and Biological Fluids, „Journal of the American Chemical Society”, 128 (10), 2006, s. 3138–3139, DOI: 10.1021/ja056957p, ISSN 0002-7863 [dostęp 2022-04-12] (ang.).
↑ HuaH. Bai HuaH. i inni, A SPR Aptasensor for Detection of Avian Influenza Virus H5N1, „Sensors”, 12 (9), 2012, s. 12506–12518, DOI: 10.3390/s120912506, ISSN 1424-8220, PMID: 23112728, PMCID: PMC3478855 [dostęp 2022-04-26] (ang.).
↑ MinM. Yuan MinM. i inni, Aptasensor for lead(II) based on the use of a quartz crystal microbalance modified with gold nanoparticles, „Microchimica Acta”, 184 (5), 2017, s. 1397–1403, DOI: 10.1007/s00604-017-2135-1, ISSN 0026-3672 [dostęp 2022-04-26] (ang.).

[1] Y.C.Y.C. Lim Y.C.Y.C., A.Z.A.Z. Kouzani A.Z.A.Z., W.W. Duan W.W., Aptasensors: A Review, „Journal of Biomedical Nanotechnology”, 6 (2), 2010, s. 93–105, DOI: 10.1166/jbn.2010.1103 [dostęp 2022-04-12] (ang.).

[2] TiborT. Hianik TiborT., JosephJ. Wang JosephJ., Electrochemical Aptasensors – Recent Achievements and Perspectives, „Electroanalysis”, 21 (11), 2009, s. 1223–1235, DOI: 10.1002/elan.200904566 [dostęp 2022-04-12] (ang.).

[3] Kyung-MiK.M. Song Kyung-MiK.M., SeonghwanS. Lee SeonghwanS., ChangillCh. Ban ChangillCh., Aptamers and Their Biological Applications, „Sensors”, 12 (1), 2012, s. 612–631, DOI: 10.3390/s120100612, ISSN 1424-8220, PMID: 22368488, PMCID: PMC3279232 [dostęp 2022-04-12] (ang.).

[4] Adeline HuilingA.H. Loo Adeline HuilingA.H., AlessandraA. Bonanni AlessandraA., MartinM. Pumera MartinM., An insight into the hybridization mechanism of hairpin DNA physically immobilized on chemically modified graphenes, „The Analyst”, 138 (2), 2013, s. 467–471, DOI: 10.1039/C2AN36199J, ISSN 0003-2654 [dostęp 2022-04-25] (ang.).

[5] MM. Pividori MM., Electrochemical genosensor design: immobilisation of oligonucleotides onto transducer surfaces and detection methods, „Biosensors and Bioelectronics”, 15 (5–6), 2000, s. 291–303, DOI: 10.1016/S0956-5663(00)00071-3 [dostęp 2022-04-26] (ang.).

[6] AudreyA. Sassolas AudreyA., Béatrice D.B.D. Leca-Bouvier Béatrice D.B.D., Loïc J.L.J. Blum Loïc J.L.J., DNA Biosensors and Microarrays, „Chemical Reviews”, 108 (1), 2007, s. 109–139, DOI: 10.1021/cr0684467, ISSN 0009-2665 [dostęp 2022-04-12] (ang.).

[7] EmilE. Paleček EmilE., MartinM. Bartošík MartinM., Electrochemistry of Nucleic Acids, „Chemical Reviews”, 112 (6), 2012, s. 3427–3481, DOI: 10.1021/cr200303p, ISSN 0009-2665 [dostęp 2022-04-12] (ang.).

[8] J. ChristopherJ.Ch. Love J. ChristopherJ.Ch. i inni, Self-Assembled Monolayers of Thiolates on Metals as a Form of Nanotechnology, „Chemical Reviews”, 105 (4), 2005, s. 1103–1170, DOI: 10.1021/cr0300789, ISSN 0009-2665 [dostęp 2022-04-12] (ang.).

[9] Noemi de-los-Santos-Alvarez i inni, Electrocatalytic Oxidation of NADH by Oxidized s-Adenosyl-L-Methionine (SAMe): Application to NADH and SAMe Determinations, „Electroanalysis”, 16 (11), 2004, s. 881–887, DOI: 10.1002/elan.200302892, ISSN 1040-0397 [dostęp 2022-04-12] (ang.).

[10] HiroakiH. Ozaki HiroakiH. i inni, Biomolecular sensor based on fluorescence-labeled aptamer, „Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters”, 16 (16), 2006, s. 4381–4384, DOI: 10.1016/j.bmcl.2006.05.054 [dostęp 2022-04-12] (ang.).

[11] Abd-ElgawadA.E. Radi Abd-ElgawadA.E., Maha RagaaM.R. Abd-Ellatief Maha RagaaM.R., Electrochemical Aptasensors: Current Status and Future Perspectives, „Diagnostics”, 11 (1), 2021, s. 104, DOI: 10.3390/diagnostics11010104, ISSN 2075-4418, PMID: 33440751, PMCID: PMC7828092 [dostęp 2022-04-26] (ang.).

[12] MònicaM. Mir MònicaM., IoanisI. Katakis IoanisI., Aptamers as elements of bioelectronic devices, „Molecular BioSystems”, 3 (9), 2007, s. 620, DOI: 10.1039/b708858b, ISSN 1742-206X [dostęp 2022-04-12] (ang.).

[13] Brian R.B.R. Baker Brian R.B.R. i inni, An Electronic, Aptamer-Based Small-Molecule Sensor for the Rapid, Label-Free Detection of Cocaine in Adulterated Samples and Biological Fluids, „Journal of the American Chemical Society”, 128 (10), 2006, s. 3138–3139, DOI: 10.1021/ja056957p, ISSN 0002-7863 [dostęp 2022-04-12] (ang.).

[14] HuaH. Bai HuaH. i inni, A SPR Aptasensor for Detection of Avian Influenza Virus H5N1, „Sensors”, 12 (9), 2012, s. 12506–12518, DOI: 10.3390/s120912506, ISSN 1424-8220, PMID: 23112728, PMCID: PMC3478855 [dostęp 2022-04-26] (ang.).

[15] MinM. Yuan MinM. i inni, Aptasensor for lead(II) based on the use of a quartz crystal microbalance modified with gold nanoparticles, „Microchimica Acta”, 184 (5), 2017, s. 1397–1403, DOI: 10.1007/s00604-017-2135-1, ISSN 0026-3672 [dostęp 2022-04-26] (ang.).

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]

[10]

[11]

[12]

[13]

[14]

[15]