Przejdź do zawartości

Biblioteka cDNA: Różnice pomiędzy wersjami

Z Wikipedii, wolnej encyklopedii
Przeglądaj historię interaktywnie
[wersja przejrzana][wersja przejrzana]
← poprzednia edycjanastępna edycja →
Usunięta treść Dodana treść
WizualnieWikikod
brak źródeł
Całkowita przebudowa artykułu, rozszerzenie, źródła
Linia 1: Linia 1:
[[Plik:Formation of a cDNA Library.jpg|thumb|250px|Schemat tworzenia biblioteki cDNA]]
{{Dopracować|źródła=2016-09}}

'''Biblioteka cDNA''' (komplementarny DNA) – fragmenty [[cDNA]] umieszczonego w komórkach bakteryjnych, np. ''[[E. coli]]''. cDNA jest odwzorowaniem [[Kwasy rybonukleinowe|mRNA]]. W komórkach eukariotycznych występują [[intron]]y które nie występują u [[prokarioty|prokariotów]]. Dlatego, aby móc wprowadzić DNA eukariotyczne do bakterii należy usunąć introny. mRNA jest to już sekwencja kodująca, która nie zawiera zbędnych informacji. Należy stworzyć DNA komplementarny do mRNA. Następnie mRNA zostaje odseparowany i nie bierze już udziału w dalszych krokach. Zostaje poddany procesowi degradacji przez [[Rybonukleazy|RNase H.]] Przy pomocy primerów syntetyzowana jest druga nić komplementarna do pierwszej. To jest cDNA. Następnie cDNA jest umieszczone w bakterii, gdzie jest powielane.
'''Biblioteka cDNA''' – rodzaj [[biblioteka genowa|biblioteki]] genowej stanowiącej zbiór kopii [[mRNA]] w formie [[cDNA]] (komplementarnego DNA) umieszczonych w określonych [[wektor genetyczny|wektorach]].

Ustalanie [[sekwencja nukleotydów|sekwencji nukleotydów]] kodujących określone [[białka|białko]] u [[eukarionty|eukariotów]] jest utrudnione ze względu na fakt, że tylko około 2% [[genom]]owego DNA może kodować białko. Pozostała część to [[sekwencja regulatorowa genu|sekwencje regulatorowe]], [[intron]]y, [[ekson|egzony]] nieulegające [[translacja (genetyka)|translacji]], różnego rodzaju niekodujące powtarzające się sekwencje. Analiza DNA związana z kodowaniem białka może być znacznie uproszczona, jeśli podda się jej tylko nieprzerwane kodujące sekwencje{{odn|Hildebrandt|Igarashi|1999|s=273–274}}. Istotne jest to również, jeśli [[ekspresja genu|ekspresję]] takich sekwencji chce się uzyskać w komórkach [[bakterie|bakterii]] czy [[drożdże|drożdży]], które same nie mogą [[splicing|usuwać]] niekodujących fragmentów{{r|Alberts1}}.

W przypadku [[prokarionty|prokariotów]] na ogół nie tworzy się się bibliotek cDNA z ich mRNA, ponieważ jest on niestabilny i prościej można przygotować [[biblioteka genomowa|biblioteki genomowe]] z wszystkimi sekwencjami genomowymi{{r|Turner}}.

Zgodnie z [[centralny dogmat biologii molekularnej|centranym dogmatem biologii molekularnej]] DNA [[transkrypcja (genetyka)|transkrybowany]] jest na mRNA, które służy jako matryca do [[biosynteza białka|syntezy białka]]{{odn|Hildebrandt|Igarashi|1999|s=273–274}}. W związku z tym mRNA reprezentuje część genomu ulegającą ekspresji ([[gen]]y){{r|Turner}}. Ponieważ do żadnego z powszechnie używanych [[wektor genetyczny|wektorów]] nie można wprowadzić [[RNA]], na podstawie mRNA syntetyzuje się komplementarne DNA (cDNA){{odn|Hildebrandt|Igarashi|1999|s=273–274}}.

W różnych komórkach czy tkankach ekspresji ulega charakterystyczny zestaw genów (a dodatkowo tę ekspresję można modyfikować), dlatego uzyskane mRNA reprezentuje tylko te geny, które w danej komórce czy tkance są aktywne i tłumaczone na białka{{r|Turner}}.

== Procedura ==
W pierwszym etapie [[izolacja RNA|izoluje się RNA]] danej tkanki czy typu komórek. Następnie oddziela się mRNA, które stanowi tylko 1–5% całkowitego RNA komórki. Wykorzystuje się unikalną cechę mRNA polegającą na występowaniu [[poliadenylacja|ogona poli(A)]] na [[koniec 3′|końcu 3’]]. Mogą one [[hybrydyzacja kwasów nukleinowych|hybrydyzować]] (łączyć się) z syntetycznym [[oligonukleotydy|oligonukleotydem]] złożonym z deoksy[[tymidyna|tymidyny]] – oligo(dT){{odn|Hildebrandt|Igarashi|1999|s=273–274}}. Można więc przykładowo przepuścić preparat RNA przez kolumnę z oligo(dT)-celulozą lub dodać oligo(dT) związany z magnetycznymi kuleczkami do [[lizat]]u komórkowego i odłączyć mRNA od reszty mieszaniny za pomocą silnego magnesu{{r|Turner}}.

Następnie sprawdza się, czy mRNA nie uległ degradacji. Można wykorzystać w tym celu [[pozakomórkowa synteza białka|bezkomórkowe systemy translacji]] (np. lizat [[retikulocyt]]ów królika) lub [[elektroforeza|elektroforezę]] żelową{{r|Turner}}. Do syntezy cDNA na matrycy mRNA wykorzystywany jest enzym [[odwrotna transkryptaza]]. Wymaga to [[RNA starterowy|startera]], którym zwykle jest oligo(dT). Do syntezy drugiej nici, po zniszczeniu nici mRNA przez hydrolizę alkaliczną, można jako starter zastosować oligo(dG). Zwykle dokonuje się również obróbki końców cDNA, aby uzyskać [[koniec lepki|lepkie końce]] ułatwiające wprowadzenie go do wektora{{r|Turner}}.

cDNA są stosunkowo krótkie (0,5–10 [[para zasad|kpz]]), dlatego do klonowania często stosuje się [[wektor plazmidowy|wektory plazmidowe]]. Do uzyskania dużej liczby klonów stosowane są również wektory pochodne [[bakteriofag lambda|faga λ]], głównie do konstruowania ekspresyjnych bibliotek cDNA{{r|Turner}}. Są to biblioteki zaprojektowane w taki sposób, aby zoptymalizować ekspresję wprowadzonego fragmentu DNA{{odn|Hildebrandt|Igarashi|1999|s=282}}.

== Przypisy ==
{{Przypisy-lista|l. kolumn=2|1=
* <ref name="Turner">{{Cytuj książkę | autor = Turner P., McLennan A., Bates A., White M. | tytuł = Krótkie Wykłady. Biologia Molekularna | wydawca = Wydawnictwo Naukowe PWN | miejsce = Warszawa | rok = 2007 | strony = 172–175 | isbn = 978-83-01-14146-2}}</ref>
* <ref name="Alberts1">{{Cytuj książkę | autor = Alberts B., Bray D., Hopkin K., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P. | tytuł = Podstawy Biologii Komórki cz. 1 | wydawca = Wydawnictwo Naukowe PWN | miejsce = Warszawa | rok = 2016 | strony = 346 | isbn = 978-83-01-14468-5}}</ref>
}}

== Bibliografia ==
* {{Cytuj książkę | nazwisko = Hildebrandt | imię = F. | nazwisko2 = Igarashi | imię2 = P. | tytuł = Techniques in Molecular Medicine | wydawca = Springer | miejsce = | rok = 1999 | rozdział = cDNA Libraries | autor r = Onuchic L. F., Germino G. G. | isbn = 978-3-642-47808-6 | doi = 10.1007/978-3-642-59811-1 | odn = tak }}


[[Kategoria:DNA]]
[[Kategoria:DNA]]

Wersja z 15:29, 21 paź 2017

Schemat tworzenia biblioteki cDNA

Biblioteka cDNA – rodzaj biblioteki genowej stanowiącej zbiór kopii mRNA w formie cDNA (komplementarnego DNA) umieszczonych w określonych wektorach.

Ustalanie sekwencji nukleotydów kodujących określone białko u eukariotów jest utrudnione ze względu na fakt, że tylko około 2% genomowego DNA może kodować białko. Pozostała część to sekwencje regulatorowe, introny, egzony nieulegające translacji, różnego rodzaju niekodujące powtarzające się sekwencje. Analiza DNA związana z kodowaniem białka może być znacznie uproszczona, jeśli podda się jej tylko nieprzerwane kodujące sekwencje[1]. Istotne jest to również, jeśli ekspresję takich sekwencji chce się uzyskać w komórkach bakterii czy drożdży, które same nie mogą usuwać niekodujących fragmentów[2].

W przypadku prokariotów na ogół nie tworzy się się bibliotek cDNA z ich mRNA, ponieważ jest on niestabilny i prościej można przygotować biblioteki genomowe z wszystkimi sekwencjami genomowymi[3].

Zgodnie z centranym dogmatem biologii molekularnej DNA transkrybowany jest na mRNA, które służy jako matryca do syntezy białka[1]. W związku z tym mRNA reprezentuje część genomu ulegającą ekspresji (geny)[3]. Ponieważ do żadnego z powszechnie używanych wektorów nie można wprowadzić RNA, na podstawie mRNA syntetyzuje się komplementarne DNA (cDNA)[1].

W różnych komórkach czy tkankach ekspresji ulega charakterystyczny zestaw genów (a dodatkowo tę ekspresję można modyfikować), dlatego uzyskane mRNA reprezentuje tylko te geny, które w danej komórce czy tkance są aktywne i tłumaczone na białka[3].

Procedura

W pierwszym etapie izoluje się RNA danej tkanki czy typu komórek. Następnie oddziela się mRNA, które stanowi tylko 1–5% całkowitego RNA komórki. Wykorzystuje się unikalną cechę mRNA polegającą na występowaniu ogona poli(A) na końcu 3’. Mogą one hybrydyzować (łączyć się) z syntetycznym oligonukleotydem złożonym z deoksytymidyny – oligo(dT)[1]. Można więc przykładowo przepuścić preparat RNA przez kolumnę z oligo(dT)-celulozą lub dodać oligo(dT) związany z magnetycznymi kuleczkami do lizatu komórkowego i odłączyć mRNA od reszty mieszaniny za pomocą silnego magnesu[3].

Następnie sprawdza się, czy mRNA nie uległ degradacji. Można wykorzystać w tym celu bezkomórkowe systemy translacji (np. lizat retikulocytów królika) lub elektroforezę żelową[3]. Do syntezy cDNA na matrycy mRNA wykorzystywany jest enzym odwrotna transkryptaza. Wymaga to startera, którym zwykle jest oligo(dT). Do syntezy drugiej nici, po zniszczeniu nici mRNA przez hydrolizę alkaliczną, można jako starter zastosować oligo(dG). Zwykle dokonuje się również obróbki końców cDNA, aby uzyskać lepkie końce ułatwiające wprowadzenie go do wektora[3].

cDNA są stosunkowo krótkie (0,5–10 kpz), dlatego do klonowania często stosuje się wektory plazmidowe. Do uzyskania dużej liczby klonów stosowane są również wektory pochodne faga λ, głównie do konstruowania ekspresyjnych bibliotek cDNA[3]. Są to biblioteki zaprojektowane w taki sposób, aby zoptymalizować ekspresję wprowadzonego fragmentu DNA[4].

Przypisy

Szablon:Przypisy-lista

Bibliografia

  1. ↑ a b c d Hildebrandt i Igarashi 1999 ↓, s. 273–274.
  2. ↑ Błąd w przypisach: Błąd w składni elementu <ref>. Brak tekstu w przypisie o nazwie Alberts1
    BŁĄD PRZYPISÓW
  3. ↑ a b c d e f g Błąd w przypisach: Błąd w składni elementu <ref>. Brak tekstu w przypisie o nazwie Turner
    BŁĄD PRZYPISÓW
  4. ↑ Hildebrandt i Igarashi 1999 ↓, s. 282.
Źródło: „https://pl.wikipedia.org/w/index.php?title=Biblioteka_cDNA&oldid=50661943”