Hybrydyzacja northern: Różnice pomiędzy wersjami

Z Wikipedii, wolnej encyklopedii
Przeglądaj historię interaktywnie
[wersja przejrzana][wersja przejrzana]
← poprzednia edycjanastępna edycja →
Usunięta treść Dodana treść
WizualnieWikikod
Kenraiz (dyskusja | edycje)
Redaktorzy
104 515 edycji
m drobne redakcyjne
uzupełnienie źródeł
Linia 16: Linia 16:


==Zastosowania metody==
==Zastosowania metody==
Głównym zastosowaniem metody northern jest analiza ekspresji genów na poziomie RNA. Przez odpowiednie zaprojektowanie sondy można uzyskać informacje o m.in. wielkości danego transkryptu i jego prekursorów<ref>{{Cytuj|autor=Edyta Koscianska, Julia Starega-Roslan, Lukasz J Sznajder, Marta Olejniczak, Paulina Galka-Marciniak|tytuł=Northern blotting analysis of microRNAs, their precursors and RNA interference triggers|czasopismo=BMC Molecular Biology|data=2011-04-11|data dostępu=2016-04-03|wydanie=1|doi=10.1186/1471-2199-12-14|pmid=21481235|pmc=3080303|url=http://www.biomedcentral.com/1471-2199/12/14|język=En}}</ref>, produktach pośrednich [[splicing]]u<ref>{{Cytuj|autor=Kapil Vashisht, Kay S. Faaberg, Amanda L. Aber, Kevin E. Brown, M. Gerard O’Sullivan|tytuł=Splice Junction Map of Simian Parvovirus Transcripts|czasopismo=Journal of Virology|data=2004-10-15|data dostępu=2016-04-03|issn=0022-538X|wydanie=20|s=10911–10919|doi=10.1128/JVI.78.20.10911-10919.2004|pmid=15452211|pmc=521819|url=http://jvi.asm.org/content/78/20/10911|język=en}}</ref>, czy jego względnej ilości w komórce. Dzięki temu można porównać profil ekspresji wybranych genów w poszczególnych tkankach<ref>{{Cytuj|autor=Shiping Liu, Song Gao, Danyu Zhang, Jiyun Yin, Zhonghuai Xiang|tytuł=MicroRNAs show diverse and dynamic expression patterns in multiple tissues of Bombyx mori|czasopismo=BMC Genomics|data=2010-02-02|data dostępu=2016-04-03|wydanie=1|doi=10.1186/1471-2164-11-85|pmid=20122259|pmc=2835664|url=http://www.biomedcentral.com/1471-2164/11/85|język=En}}</ref><ref name=":1">{{Cytuj|autor=Wigard P. Kloosterman, Florian A. Steiner, Eugene Berezikov, Ewart de Bruijn, Jose van de Belt|tytuł=Cloning and expression of new microRNAs from zebrafish|czasopismo=Nucleic Acids Research|data=2006-01-01|data dostępu=2016-04-03|issn=0305-1048|wydanie=9|s=2558–2569|doi=10.1093/nar/gkl278|pmid=16698962|pmc=3303176|url=http://nar.oxfordjournals.org/content/34/9/2558|język=en}}</ref>, na różnych etapach rozwoju<ref name=":1" /> czy zmiany ekspresji pod wpływem różnych czynników (np. stres środowiskowy<ref>{{Cytuj|autor=Amit A Deokar, Vishwajith Kondawar, Pradeep K Jain, S Mohan Karuppayil, N L Raju|tytuł=Comparative analysis of expressed sequence tags (ESTs) between drought-tolerant and -susceptible genotypes of chickpea under terminal drought stress|czasopismo=BMC Plant Biology|data=2011-04-22|data dostępu=2016-04-03|wydanie=1|doi=10.1186/1471-2229-11-70|pmid=21513527|pmc=3110109|url=http://www.biomedcentral.com/1471-2229/11/70|język=En}}</ref>, leki<ref>{{Cytuj|autor=Rashmi Narendrula, Kyle Mispel-Beyer, Baoqing Guo, Amadeo M. Parissenti, Laura B. Pritzker|tytuł=RNA disruption is associated with response to multiple classes of chemotherapy drugs in tumor cell lines|czasopismo=BMC Cancer|data=2016-02-24|data dostępu=2016-04-03|wydanie=1|doi=10.1186/s12885-016-2197-1|pmid=26911141|pmc=4765116|url=http://www.biomedcentral.com/1471-2407/16/146|język=En}}</ref>, zakażenie patogenem i in.).
Głównym zastosowaniem metody northern jest analiza ekspresji genów na poziomie RNA. Przez odpowiednie zaprojektowanie sondy można uzyskać informacje o m.in. wielkości danego transkryptu, produktach pośrednich [[splicing]]u, czy jego względnej ilości w komórce. Dzięki temu można porównać profil ekspresji wybranych genów w poszczególnych tkankach, na różnych etapach rozwoju czy zmiany ekspresji pod wpływem różnych czynników (np. stres środowiskowy, leki, zakażenie patogenem i in.).


{{Przypisy}}
{{Przypisy}}
Linia 24: Linia 24:
| nazwisko = Sambrook
| nazwisko = Sambrook
| imię = Josep
| imię = Josep
⚫
| nazwisko2 = Russell
| imię2 = David W.
| tytuł = Molecular cloning: a laboratory manual
| tytuł = Molecular cloning: a laboratory manual
| data = 2001
| data = 2001
| wydawca = Cold Spring Harbour
| wydawca = Cold Spring Harbour
| miejsce = New York
| miejsce = New York
| isbn = 0879695773}}
| imię2 = David W.
⚫
| nazwisko2 = Russell
|rozdział=Chapter 7. Extraction, Purification, and Analysis of mRNA from Eukaryotic Cells| isbn = 0879695773}}


[[Kategoria:RNA]]
[[Kategoria:RNA]]

Wersja z 16:33, 3 kwi 2016

Artykuł ten został zgłoszony do umieszczenia na stronie głównej w rubryce „Czy wiesz”.
Pomóż nam go sprawdzić: oceń zgłoszoną nominację.

Hybrydyzacja northern (ang. northern blot) – stosowana w biologii molekularnej metoda służąca do detekcji określonych sekwencji RNA. Najczęściej stosuje się ją do wykrywania mRNA genów ulegających transkrypcji w komórce. Technika została opracowana przez Jamesa Alwine’a, Davida Kempa i George’a Starka z Uniwersytetu Stanforda w 1977 roku[1]. Nazwa metody jest grą angielskich słów z nazwą wcześniejszej metody wykrywania sekwencji DNA, zwanej (od nazwiska twórcy, Edwina Southerna) hybrydyzacją Southerna (ang. southern – południowy; northern – północny).

Metodyka

Procedura rozpoczyna się izolacją RNA z materiału biologicznego (np. zhomogenizowana tkanka, kultura komórkowa, izolowane organelle). Zależnie od eksperymentu, można użyć całkowitego RNA lub oczyszczonej frakcji poli(A), która zawiera jedynie poliadenylowane RNA. Jest tym samym wzbogacona w cząsteczki mRNA w porównaniu z całkowitym RNA (gdzie ilościowo przeważają cząsteczki rRNA i tRNA), co pozwala na badanie genów o niskim poziomie ekspresji. Oczyszczanie frakcji poli(A) można przeprowadzić np. z użyciem celulozy zmodyfikowanej kwasem oligotymidynowym – oligo(dT)[2].

Wyizolowany RNA poddaje się rozdziałowi elektroforetycznemu w warunkach denaturujących. Stosowane czynniki denaturujące to: mieszanina glioksalu z DMSO[3][4], formaldehyd[5], formamid, mocznik[6]. Współcześnie najszerzej stosowane są żele agarozowe z dodatkiem formaldehydu albo poliakrylamidowe z dodatkiem mocznika. Te ostatnie pozwalają na rozdzielenie mniejszych cząsteczek RNA, stąd są używane przy detekcji tzw. małych RNA (ang. small RNAs np. siRNA, miRNA)[7].

Kolejnym etapem jest transfer RNA na membranę. W zależności od użytej metody rozdziału stosuje się transfer kapilarny (do żeli agarozowych) albo transfer w polu elektrycznym (do żeli poliakrylamidowych). Transfer kapilarny prowadzi się podobnie jak w metodzie Southerna – żel układa się na arkusz papieru filtracyjnego zanurzony w rezerwuarze roztworu do transferu, na żel kładzie się membranę (nitrocelulozową[3] lub nylonową[8]), którą pokrywa się kilkoma arkuszami papieru filtracyjnego i stosem suchych, papierowych ręczników. Na koniec całą konstrukcję przyciska się równomiernie ok. półkilogramowym obciążnikiem. Transfer prowadzi się zwykle kilkanaście godzin (12-16 h). Za transport odpowiadają siły kapilarne. Roztwór migruje pionowo od naczynia przez żel i membranę do papierowych ręczników, a wraz z nim wędrują cząsteczki RNA. Transfer w polu elektrycznym (analogiczny do stosowanego w metodzie western) stosuje się w przypadku żeli poliakrylamidowych. Przepływ prądu powoduje przeniesienie ujemnie naładowanych cząsteczek RNA z żelu na membranę.

RNA ulega adsorpcji na membranie dzięki oddziaływaniom hydrofobowym. Utrwalenie kwasów nukleinowych na membranie (po zakończeniu transferu) osiąga się przez wypiekanie w wysokiej temperaturze (dla membran nitrocelulozowych) lub naświetlanie lampą UV[9] (dla membran nylonowych), co prowadzi do utworzenia wiązań kowalencyjnych między cząsteczkami kwasu nukleinowego a cząsteczkami powierzchni membrany. Proces utrwalania jest znany w żargonie pod angielską nazwą cross-linking.

Ocena jakości RNA na membranie i efektywności transferu jest możliwa dzięki barwieniu roztworem błękitu metylenowego[10].

Tak przygotowaną membranę umieszcza się w roztworze prehybrydyzacyjnym (blokowanie membrany), a następnie hybrydyzacyjnym – zawierającym sondę. Sondą może być odcinek DNA lub RNA o sekwencji komplementarnej do wykrywanego fragmentu RNA. Sondę należy wcześniej wyznakować, by możliwa była jej detekcja. Najpopularniejsze są sondy znakowane radioaktywnie (izotopem 35P), używa się również sond znakowanych biotyną lub digoksygeniną[11]. Po etapie hybrydyzacji membranę płucze się w celu pozbycia się nadmiaru niezwiązanej sondy. Detekcję radioaktywnych sond prowadzi się z użyciem kliszy fotograficznych. Sondy nieradioaktywne wykrywa się za pomocą streptawidyny (łączy się z biotyną) lub przeciwciał przeciwko digoksygeninie skoniugowanych z fluoroforem lub peroksydazą chrzanową (detekcja analogiczna do metody western)[12].

Zastosowania metody

Głównym zastosowaniem metody northern jest analiza ekspresji genów na poziomie RNA. Przez odpowiednie zaprojektowanie sondy można uzyskać informacje o m.in. wielkości danego transkryptu i jego prekursorów[13], produktach pośrednich splicingu[14], czy jego względnej ilości w komórce. Dzięki temu można porównać profil ekspresji wybranych genów w poszczególnych tkankach[15][16], na różnych etapach rozwoju[16] czy zmiany ekspresji pod wpływem różnych czynników (np. stres środowiskowy[17], leki[18], zakażenie patogenem i in.).

  1. ↑ J C Alwine, D J Kemp, G R Stark, Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes., „Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America”, 12, 1977, s. 5350–5354, ISSN 0027-8424, PMID: 414220, PMCID: PMC431715 [dostęp 2016-02-06].
  2. ↑ Haim Aviv, Philip Leder, Purification of Biologically Active Globin Messenger RNA by Chromatography on Oligothymidylic acid-Cellulose, „Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America”, 6, 1972, s. 1408–1412, ISSN 0027-8424, PMID: 4504350, PMCID: PMC426713 [dostęp 2016-02-14].
  3. ↑ a b P S Thomas, Hybridization of denatured RNA and small DNA fragments transferred to nitrocellulose., „Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America”, 9, 1980, s. 5201–5205, ISSN 0027-8424, PMID: 6159641, PMCID: PMC350025 [dostęp 2016-02-14].
  4. ↑ G K McMaster, G G Carmichael, Analysis of single- and double-stranded nucleic acids on polyacrylamide and agarose gels by using glyoxal and acridine orange., „Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America”, 11, 1977, s. 4835–4838, ISSN 0027-8424, PMID: 73185, PMCID: PMC432050 [dostęp 2016-02-14].
  5. ↑ N Rave, R Crkvenjakov, H Boedtker, Identification of procollagen mRNAs transferred to diazobenzyloxymethyl paper from formaldehyde agarose gels., „Nucleic Acids Research”, 11, 1979, s. 3559–3567, ISSN 0305-1048, PMID: 573889, PMCID: PMC327956 [dostęp 2016-02-14].
  6. ↑ Heike Summer, René Grämer, Peter Dröge, Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE), „Journal of Visualized Experiments : JoVE”, 32, 2009, DOI: 10.3791/1485, ISSN 1940-087X, PMID: 19865070, PMCID: PMC3329804 [dostęp 2016-02-14].
  7. ↑ Donald C. Rio, Northern Blots for Small RNAs and MicroRNAs, „Cold Spring Harbor Protocols”, 7, 2014, pdb.prot080838, DOI: 10.1101/pdb.prot080838, ISSN 1940-3402, PMID: 24987143 [dostęp 2016-02-14] (ang.).
  8. ↑ K C Reed, D A Mann, Rapid transfer of DNA from agarose gels to nylon membranes., „Nucleic Acids Research”, 20, 1985, s. 7207–7221, ISSN 0305-1048, PMID: 4059056, PMCID: PMC322039 [dostęp 2016-02-14].
  9. ↑ E.W. Khandjian, Optimized Hybridization of DNA Blotted and Fixed to Nitrocellulose and Nylon Membranes, „Bio/Technology”, 2, s. 165–167, DOI: 10.1038/nbt0287-165.
  10. ↑ D.L. Herrin, G.W. Schmidt, Rapid, reversible staining of northern blots prior to hybridization, „BioTechniques”, 3, 1988, s. 196–197, 199-200, ISSN 0736-6205, PMID: 2483319 [dostęp 2016-02-14].
  11. ↑ M Farquharson, R Harvie, A M McNicol, Detection of messenger RNA using a digoxigenin end labelled oligodeoxynucleotide probe., „Journal of Clinical Pathology”, 5, 1990, s. 424–428, ISSN 0021-9746, PMID: 2370311, PMCID: PMC502456 [dostęp 2016-02-14].
  12. ↑ M.I. Shifman, D.G. Stein, A reliable and sensitive method for non-radioactive northern blot analysis of nerve growth factor mRNA from brain tissues, „Journal of Neuroscience Methods”, 2, 1995, s. 205–208, ISSN 0165-0270, PMID: 8531488 [dostęp 2016-02-14].
  13. ↑ Edyta Koscianska i inni, Northern blotting analysis of microRNAs, their precursors and RNA interference triggers, „BMC Molecular Biology”, 1, 2011, DOI: 10.1186/1471-2199-12-14, PMID: 21481235, PMCID: PMC3080303 [dostęp 2016-04-03] (ang.).
  14. ↑ Kapil Vashisht i inni, Splice Junction Map of Simian Parvovirus Transcripts, „Journal of Virology”, 20, 2004, s. 10911–10919, DOI: 10.1128/JVI.78.20.10911-10919.2004, ISSN 0022-538X, PMID: 15452211, PMCID: PMC521819 [dostęp 2016-04-03] (ang.).
  15. ↑ Shiping Liu i inni, MicroRNAs show diverse and dynamic expression patterns in multiple tissues of Bombyx mori, „BMC Genomics”, 1, 2010, DOI: 10.1186/1471-2164-11-85, PMID: 20122259, PMCID: PMC2835664 [dostęp 2016-04-03] (ang.).
  16. ↑ a b Wigard P. Kloosterman i inni, Cloning and expression of new microRNAs from zebrafish, „Nucleic Acids Research”, 9, 2006, s. 2558–2569, DOI: 10.1093/nar/gkl278, ISSN 0305-1048, PMID: 16698962, PMCID: PMC3303176 [dostęp 2016-04-03] (ang.).
  17. ↑ Amit A Deokar i inni, Comparative analysis of expressed sequence tags (ESTs) between drought-tolerant and -susceptible genotypes of chickpea under terminal drought stress, „BMC Plant Biology”, 1, 2011, DOI: 10.1186/1471-2229-11-70, PMID: 21513527, PMCID: PMC3110109 [dostęp 2016-04-03] (ang.).
  18. ↑ Rashmi Narendrula i inni, RNA disruption is associated with response to multiple classes of chemotherapy drugs in tumor cell lines, „BMC Cancer”, 1, 2016, DOI: 10.1186/s12885-016-2197-1, PMID: 26911141, PMCID: PMC4765116 [dostęp 2016-04-03] (ang.).

Bibliografia

  • Chapter 7. Extraction, Purification, and Analysis of mRNA from Eukaryotic Cells. W: Josep Sambrook, David W. Russell: Molecular cloning: a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbour, 2001. ISBN 0-87969-577-3.
Źródło: „https://pl.wikipedia.org/w/index.php?title=Hybrydyzacja_northern&oldid=45470361”