Hodowla wirusów
Hodowla wirusów – namnażanie wirusów w żywych komórkach w warunkach laboratoryjnych.
Rys historyczny[edytuj | edytuj kod]
W latach 30. XX w. opracowano metody hodowli wirusów w zarodkach kurzych. W latach 40. rozwinięto techniki hodowli komórek, składy pożywek, pojawiła się możliwość użycia antybiotyków[1]. W 1949 John Enders ze współpracownikami zdołał namnożyć wirusa polio w komórkach ludzkich hodowanych in vitro. To osiągnięcie doprowadziło do identyfikacji i izolacji wielu wirusów w latach 50. i 60. oraz powiązanie ich z chorobami[2]. W latach 70. znacznie rozwinęła się diagnostyka wirusologiczna dzięki pojawieniu się reagentów o wysokiej czystości oraz dostępności gotowych linii komórkowych[3].
Wybór systemu hodowli[edytuj | edytuj kod]
Generalnie wirusy mogą replikować się tylko w żywych komórkach[4]. Czasami trudno jest znaleźć odpowiednią linię komórek, w której dane wirusy by się namnażały[5].
Bakteriofagi hoduje się w kulturach bakterii. Wirusy roślin można hodować w specjalnie do tego celu uprawianych roślinach lub też w kulturach protoplastów (komórek roślinnych pozbawionych ściany komórkowej). Wirusy zwierzęce najczęściej namnaża się w hodowanych komórkach zwierzęcych. Poza tym można je hodować w całych organizmach zwierzęcych (np. w myszach) lub pewnych organach, w jajach zawierających kurzy zarodek lub w larwach insektów[5][6].
W przypadku wirusów zwierzęcych i ludzkich żywe organizmy jako gospodarze są wykorzystywane w badaniu patogenezy, immunologii, podczas testowania szczepionek, leków[4]. Wykorzystywanie zwierząt wzbudza zastrzeżenia natury etycznej[6], m.in. dlatego do badania replikacji, do celów diagnostycznych stosowane są komórkowe kultury in vitro[4]. Kultury komórkowe wyparły też w dużej mierze hodowle wirusów w zarodkach kurzych – te stosuje się obecnie w przypadku wirusów ptaków, pokswirusów i wirusów grypy[7].
Hodowla wirusów w kulturach komórkowych[edytuj | edytuj kod]
Komórki do hodowli wirusów są utrzymywane w pożywce zapewniającej substancje odżywcze, odpowiednie pH, ciśnienie osmotyczne w warunkach sterylnych. W przypadku hodowli komórek zwierzęcych podłoża zwykle zawierają 5–10% surowicy krwi[6]. Większość komórek rośnie w formie pojedynczej warstwy na powierzchni naczynia hodowlanego, rzadziej rosną zawieszone w pożywce[5].
Komórki do hodowli wirusów mogą rosnąć jako kultury pierwotne (komórki pozyskane bezpośrednio z tkanek zwierząt), diploidalne linie komórkowe lub ciągłe linie komórkowe (nieśmiertelne, pochodzenia nowotworowego lub powstałe przez spontaniczną transformację diploidalnych)[8].
Wiele wirusów zabija zainfekowaną komórkę, dokonuje w nich uszkodzeń, które stają się widoczne w monowarstwie hodowanych komórek. Zmiany spowodowane wtargnięciem wirusa do komórki nazywa się efektem cytopatycznym. W większości przypadków zmiany te w komórkach zwierzęcych można zaobserwować pod zwykłym mikroskopem świetlnym[9].
Wykrywanie wirusów[edytuj | edytuj kod]
Same wirusy mogą być uwidocznione tylko za pomocą mikroskopu elektronowego, i w dodatku muszą występować w ilości powyżej 1011 cząstek na ml. W związku z tym wirusy na ogół wykrywa się następującymi metodami pośrednimi:
- namnażanie wirusów w odpowiednich hodowlach komórkowych i badanie, jakie następstwa powoduje infekcja;
- techniki serologiczne – badanie interakcji między wirusem a przeciwciałem skierowanym przeciwko niemu[6] (np. testy wykorzystujące aglutynację, immunofluorescencję, testy radioimmunologiczne, ELISA, western blot[2]);
- wykrywanie wirusowego kwasu nukleinowego – często stosuje się PCR[6].
Oczyszczanie preparatów wirusowych[edytuj | edytuj kod]
Materiał płynny zawierający wirusy jest przesączany przez filtry o porach różnej wielkości. Przesącz taki jest pozbawiony bakterii, ale oprócz wirusów zawiera również obce cząsteczki i sole. W celu ich oddzielenia można stosować dializę, wirowanie i ultrawirowanie (na ogół 40 000–100 000 × g). Wiriony można strącać przez dodatek niektórych nieorganicznych soli (np. siarczan amonu, siarczan sodu), etanolu, acetonu. Inną metodą wytrącania jest doprowadzenie roztworu do takiego pH, w którym wirus traci ładunek elektrostatyczny (punkt izoelektryczny). Ponadto stosuje się różne metody chromatograficzne (adsorpcyjna, jonowa, żelowa, powinowactwa). W procesach oczyszczania mogą przykładowo brać udział receptory na powierzchni wirusów, które w określonych warunkach wiążą się z innymi komórkami[10].
Zastosowanie hodowli wirusów[edytuj | edytuj kod]
Hodowla wirusów umożliwia:
- izolację i identyfikację wirusów w materiale klinicznym;
- produkcję szczepionek i antygenów dla testów serologicznych;
- przeprowadzanie badań nad wirusami[8].
Zobacz też[edytuj | edytuj kod]
Przypisy[edytuj | edytuj kod]
- ↑ Göran W.: Cultivation of viruses. W: Lycke E., Norrby E.: Textbook of Medical Virology. Butterworth &Co., 1983, s. 38.
- ↑ a b Cann A.J.: Principles of Molecular Virology. Elsevier, 2005, s. 7–9. ISBN 0-12-088787-8.
- ↑ Leland D.S., Ginocchio C.C.. Role of Cell Culture for Virus Detection in the Age of Technology. „Clinical Microbiology Reviews”. 20 (1), s. 49–78, 2007. DOI: 10.1128/CMR.00002-06.
- ↑ a b c Fenner i in. 1987 ↓, s. 39.
- ↑ a b c Carter J., Saunders V.: Virology. Principles and Applications. Wiley, 2007, s. 12. ISBN 978-0-470-02386-0.
- ↑ a b c d e Dimmock N.J., Easton A.J., Leppard K.N.: Introduction to Modern Virology. Blackwell Publishing, 2007, s. 18–22. ISBN 978-1405136457.
- ↑ Fenner i in. 1987 ↓, s. 46–47.
- ↑ a b Fenner i in. 1987 ↓, s. 41–43.
- ↑ Fenner i in. 1987 ↓, s. 45.
- ↑ Kańtoch M.: Wirusologia lekarska. Warszawa: Wydawnictwo Lekarskie PZWL, 1998, s. 34–36. ISBN 83-200-2218-5.
Bibliografia[edytuj | edytuj kod]
- F. Fenner, P.A. Bachmann, E.P.J. Gibbs, F.A. Murphy, M.J. Studdert, D.O. White: Veterinary Virusology. Orlando: Academic Press, Harcourt Brace Jovanovich, 1987. ISBN 0-12-253055-1.